SC/T 7244-2025 虾类传染性早熟病毒感染诊断方法

水产行业标准 SC/T 7244-2025《虾类传染性早熟病毒感染诊断方法》主要内容总结

​一、标准适用范围​

适用于虾类（特别是罗氏沼虾等易感宿主）传染性早熟病毒（IPV）感染的流行病学调查、诊断、检疫及监测，涵盖以下检测方法：

• ​组织病理学检测​
• ​原位杂交检测​
• ​套式RT-PCR检测​
• ​RT-qPCR检测​
• ​RT-LAMP检测​

​二、核心检测方法及流程​

1. ​临床症状​

• ​典型特征​：性腺发育提前（60-80日龄体长5-7cm时出现副性征）、生长迟缓、甲壳硬化、活力下降。
• ​具体表现​：
  • 雌虾：非繁殖期抱卵
  • 雄虾：第二步足超体长1.5倍，指节淡黄色/蓝色，外侧带绒毛

2. ​样品采集与保存​

• ​对象​：罗氏沼虾等易感虾类
• ​组织要求​：
  • ​病理学/原位杂交​：优先采集眼柄、头胸甲
  • ​分子检测​：仔虾（完整无眼个体）、幼虾/成虾（去眼球眼柄、脑、鳃等）、亲虾（非致死取步足或眼柄）
• ​保存运输​：按GB/T 28630.4-2012要求，使用4%多聚甲醛固定液或RNA保存液

3. ​关键检测技术​

​​（1）组织病理学检测​

• ​流程​：固定→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片（5μm）→苏木精-伊红染色→显微镜观察
• ​阳性判定​：复眼半椭球体、神经节层等部位出现嗜酸性包涵体​（图C.1-C.3）

​​（2）原位杂交检测​

• ​探针​：地高辛标记套式RT-PCR产物（395bp靶序列）
• ​流程​：切片预处理→蛋白酶K消化→探针杂交→显色（BCIP/NBT）→显微镜观察
• ​阳性判定​：组织细胞质内出现蓝黑色杂交信号​（图D.1-D.3）

​​（3）套式RT-PCR检测​

• ​引物设计​：
  • 外侧引物（IPV-F1/R1）：扩增1038bp
  • 内侧引物（IPV-F2/R2）：扩增395bp
• ​流程​：RNA提取→cDNA合成→两轮扩增→电泳验证→测序比对
• ​阳性判定​：扩增出目标条带且序列与IPV参考序列一致性≥95%

​​（4）RT-qPCR检测​

• ​引物/探针​：
  • IPV-F/R：扩增140bp
  • 探针IPV-P：FAM-TAMRA标记
• ​判定标准​：
  • Ct≤37且呈S型曲线→阳性
  • 37<Ct≤40需复测确认

​​（5）RT-LAMP检测​

• ​引物设计​：含FIP/BIP/F3/B3/LpF五条引物
• ​判定标准​：
  • Ct≤30且呈S型曲线→阳性
  • 30<Ct≤45需复测确认

​三、综合判定标准​

• ​疑似病例​：符合临床症状或任一检测方法阳性
• ​确诊病例​：分子检测阳性且符合临床症状/病理学特征
• ​阴性病例​：无典型症状且所有检测阴性

​四、支持性内容​

• ​附录A​：试剂配制方法（如DEPC水、预杂交液等）
• ​附录B​：IPV病原特征（正义单链RNA病毒，直径40-60nm）
• ​附录C/D​：病理学及原位杂交典型图例
• ​附录E​：引物在病毒基因组中的位置及产物序列（图E.1-E.3）

​五、仪器与试剂要求​

• ​关键设备​：PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳系统、组织脱水机、光学显微镜等
• ​核心试剂​：探针、引物（序列见标准正文）、逆转录酶、Taq聚合酶、显色底物等

​六、实施时间​

• ​发布日期​：2025年1月9日
• ​实施日期​：2025年5月1日

​总结​：该标准系统规范了IPV感染的诊断流程，整合了传统病理学与分子生物学技术，强调多方法联合判定，确保诊断的准确性，为虾类健康养殖和疫病防控提供了技术依据。