SC/T 7246-2025 蛙脑膜炎诊断方法
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- 标准类型：农牧渔类
- 标准语言：中文版
- 文件类型：PDF文档
- 更新时间：2025-05-18
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资料介绍
水产行业标准SC/T 7246-2025《蛙脑膜炎诊断方法》主要内容总结如下：
一、适用范围
适用于米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingia miricola）引起的牛蛙、黑斑蛙、棘胸蛙等蛙类脑膜炎的流行病学调查、诊断、检疫和监测。
二、规范性引用文件
包括GB/T 6682（实验室用水标准）、SC/T 7011.1/7011.2（水生动物疾病术语与命名）、SC/T 7202.3-2007（组织病理学诊断法）等。
三、术语定义
- 蛙脑膜炎：由米尔伊丽莎白菌感染引发的疾病，典型症状包括平衡失调、歪头、眼膜发白、眼球晶状体不透明等（附图C.1示例）。
四、试剂与材料
- 化学试剂：乙醚、氯仿、石蜡、琼脂糖、SYBR Green qPCR预混液等。
- 缓冲液与配制（附录A）：
- 抽提缓冲液（含Tris-HCl、EDTA、SDS等）
- 10 mol/L乙酸铵、TE缓冲液、电泳缓冲液等。
- 引物序列：
- 套式PCR：第一轮引物EMi-576F1/R1（扩增576 bp片段），第二轮EMi-308F2/R2（扩增308 bp片段）。
- qPCR引物：EMi-q137F/R（扩增137 bp片段）。
- 对照设置：阳性对照（米尔伊丽莎白菌DNA）、阴性对照（健康蛙组织）、空白对照（水）。
五、仪器设备
包括切片机、PCR仪、荧光定量PCR仪、高速离心机、电泳仪、显微镜等实验室设备。
六、临床症状
病蛙表现为：
- 反应迟钝、离群独游
- 典型症状：头部歪斜、身体失衡打转、眼膜发白、眼球晶状体浑浊（图C.1）。
七、样品采集与处理
- 对象：优先选择有症状的蝌蚪或蛙，无症状样本需采集≥150尾/只，有症状≥30尾/只。
- 组织选择：取脑、眼膜、心脏组织，无菌操作。
- 保存运输：冷藏运送，避免DNA降解。
八、检测方法
1. 组织病理学检测
- 步骤：麻醉活蛙→取脑/眼组织→4%多聚甲醛固定→石蜡包埋切片→苏木精-伊红染色→显微镜观察。
- 阳性判定：脑膜炎（脑膜炎症，图C.2）或眼内炎/角膜上皮增生（图C.3）。
2. 套式PCR检测
- DNA提取：酚-氯仿法或商品化试剂盒。
- 扩增程序：
- 第一轮PCR（30循环）：95℃ 5min→94℃ 30s→66℃ 30s→72℃ 40s。
- 第二轮PCR（30循环）：95℃ 5min→94℃ 30s→66℃ 30s→72℃ 30s。
- 结果判定：
- 第一轮产物576 bp，第二轮308 bp。
- 测序比对（与GenBank CP040516一致性≥96%）确认阳性。
3. 染料法qPCR检测
- 反应体系：SYBR Green预混液，引物终浓度0.2 μmol/L。
- 扩增程序：95℃ 10min→40循环（95℃ 10s→62℃ 30s）。
- 判定标准：
- Ct≤35且熔解曲线单峰（81.0±0.8℃）为阳性；
- 35<Ct<40需复测确认。
九、综合判定
- 疑似病例：符合以下任一条件：
- 典型临床症状；
- 组织病理阳性；
- PCR或qPCR阳性。
- 确诊病例：PCR/qPCR阳性且符合临床症状或组织病理阳性。
- 阴性病例：无典型症状、组织病理阴性且PCR/qPCR阴性。
十、附录
- 附录A：试剂配方（抽提缓冲液、蛋白酶K、电泳缓冲液等）。
- 附录B：引物靶基因位置（GenBank CP040516）。
- 附录C：临床症状与病理特征图示（图C.1-C.3）。
关键质量控制
- 对照设置：每批次实验需包含阳性、阴性及空白对照。
- 重复检测：qPCR临界值样本需复测确认。
- 测序验证：PCR阳性样本需测序比对确保特异性。
该标准为蛙脑膜炎的诊断提供了系统化的技术流程，涵盖从临床症状观察到分子检测的综合方法，适用于水产养殖病害防控与检疫。