DB1302/T 327-2012 克伦特罗等3种β-受体激动剂检测技术规范

​​唐山市地方标准 DB1302/T 327-2012《克仑特罗等3种β-受体激动剂检测技术规范》主要内容总结​​

​​1. 标准概述​​

• ​​适用范围​​：适用于猪、牛、羊的尿液和组织（肌肉/肝脏）中克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺3种β-受体激动剂残留的检测。
• ​​检测方法​​：包括胶体金免疫层析法（快速筛查）、酶联免疫吸附法（ELISA，筛选检测）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS，确证检测）。
• ​​层级分工​​：
  • ​​基层​​（动物卫生监督部门、养殖企业）：胶体金试纸条现场快速检测。
  • ​​县/区级检测中心​​：酶联免疫吸附法（ELISA）。
  • ​​市级监测中心​​：LC-MS/MS确证检测。

​​2. 规范性引用文件​​

• 包括GB/T 6682（实验室用水标准）、NY/T 763（抽样方法）、农业部1063号公告-3-2008（尿液LC-MS/MS法）、农业部1025号公告-18-2008（组织LC-MS/MS法）等。

​​3. 抽样方法​​

• ​​猪​​：按NY/T 763-2004执行。
• ​​牛/羊​​：参照NY/T 763-2004。

​​4. 胶体金免疫层析法（快速检测）​​

• ​​原理​​：竞争抑制免疫层析，样品中目标物与胶体金标记抗体结合，抑制其与NC膜上偶联物的结合。
• ​​前处理​​：
  • ​​尿液​​：离心或静置去除浑浊。
  • ​​组织​​：均质后加热提取。
• ​​结果判定​​：
  • ​​阴性​​：T线（检测线）和C线（质控线）均显色。
  • ​​阳性​​：T线不显色，C线显色。
  • ​​无效​​：C线未出现（需重测）。
• ​​环境要求​​：10℃~30℃。

​​5. 酶联免疫吸附法（ELISA）​​

​​5.1 克仑特罗ELISA​​

• ​​原理​​：直接竞争ELISA，HRP标记克仑特罗与样品中目标物竞争结合抗体。
• ​​前处理​​：
  • ​​尿液​​：直接检测或离心。
  • ​​组织​​：盐酸-氯化钠混合液提取，调节pH至5.5~6.0。
• ​​检测步骤​​：加样→温育→洗涤→显色→450nm读数。
• ​​结果计算​​：通过标准曲线计算浓度，组织样品稀释倍数4，尿液不稀释。

​​5.2 沙丁胺醇ELISA​​

• ​​原理​​：同克仑特罗，但提取液为盐酸溶液，稀释倍数3（尿液）或5（组织）。

​​5.3 莱克多巴胺ELISA​​

• ​​原理​​：间接竞争ELISA，目标物与酶标板抗原竞争结合抗体，再与酶标二抗结合。
• ​​前处理​​：组织需氯化钠提取液提取，稀释倍数5。

​​6. 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS，确证检测）​​

​​6.1 尿液检测​​

• ​​前处理​​：
  1. 叔丁醇-叔丁基甲醚萃取，调节pH至9~10。
  2. 固相萃取（MCX柱）净化，氨水甲醇洗脱。
• ​​检测限（LOD）​​：0.1 ng/mL；​​定量限（LOQ）​​：0.2 ng/mL。
• ​​内标法​​：使用克仑特罗-D9、沙丁胺醇-D3、莱克多巴胺-D5同位素内标。

​​6.2 组织检测​​

• ​​前处理​​：
  1. ​​酶解​​：β-葡萄糖醛苷酶/硫酸酯酶37℃水解16小时。
  2. ​​提取​​：高氯酸沉淀蛋白，乙酸乙酯和叔丁基甲醚分步萃取。
  3. ​​净化​​：MCX柱净化，氨水甲醇洗脱。
• ​​检测限（LOD）​​：0.25 μg/kg；​​定量限（LOQ）​​：0.5 μg/kg。
• ​​标准曲线​​：空白组织添加0.25~5 μg/kg系列浓度。

​​7. 关键点总结​​

1. ​​方法选择​​：根据检测层级选择胶体金（快速）、ELISA（筛选）或LC-MS/MS（确证）。
2. ​​样品差异​​：
   • ​​尿液​​：直接或简单离心后检测。
   • ​​组织​​：需均质、酶解、复杂提取和净化。
3. ​​质量控制​​：
   • 胶体金法需控制环境温度。
   • ELISA和LC-MS/MS需标准曲线和内标校准。
4. ​​灵敏度​​：LC-MS/MS灵敏度最高（0.1 ng/mL尿液，0.25 μg/kg组织）。

该标准提供了从现场快速筛查到实验室确证的完整技术流程，确保β-受体激动剂残留检测的准确性和可靠性。