DB46/T 711-2025 胡椒瘟病病原菌分子检测技术规范

　　海南省地方标准

　　DB 46/T 711—2025

　　胡椒瘟病病原菌 分子检测技术规范

　　Technical specification for pathogen molecular detection of black pepper Phytophtora

　　foot rot

　　2025 - 08 - 11 发布 2025 - 10 - 31 实施

　　海南省市场监督管理局 发布

　　目次

　　前言 ................................................................................. II

　　1 范围 ............................................................................... 1

　　2 规范性引用文件 ..................................................................... 1

　　3 术语和定义 ......................................................................... 1

　　4 原理 ............................................................................... 1

　　5 器材与试剂 ......................................................................... 1

　　主要器材 ....................................................................... 1

　　主要试剂 ....................................................................... 2

　　6 检测方法 ........................................................................... 2

　　样品采集 ....................................................................... 2

　　DNA 提取 ........................................................................ 2

　　PCR 反应 ........................................................................ 2

　　PCR 产物检测 .................................................................... 3

　　7 结果判定 ........................................................................... 3

　　8 结果记录与档案保存 ................................................................. 3

　　9 样品处置 ........................................................................... 3

　　附录A(资料性) 胡椒瘟病病原菌分子检测报告表 ......................................... 4

　　附录B(资料性) PCR 产物电泳图谱 ..................................................... 5

　　参考文献 .............................................................................. 6

　　图B.1 PCR 产物电泳图谱 ............................................................... 5

　　表1 PCR 反应体系 ..................................................................... 3

　　表A.1 胡椒瘟病病原菌分子检测报告表 ................................................... 4

　　DB 46/T 711—2025

　　II

　　前言

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

　　起草。

　　请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

　　本文件由海南省农业农村厅提出并归口。

　　本文件起草单位：中国热带农业科学院香料饮料研究所。

　　本文件主要起草人：高圣风、王亚男、苟亚峰、孙世伟、刘世超、杨建峰、田甜、温思为。

　　DB 46/T 711—2025

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　　胡椒瘟病病原菌分子检测技术规范

　　1 范围

　　本文件确立了胡椒瘟病病原菌(Phytophtora capsici)PCR检测的原理，规定了器材和试剂、检测

　　方法、结果判定、结果记录与档案保存、样品处置的要求和方法。

　　本文件适用于胡椒种苗及大田植株上的胡椒瘟病病原菌的PCR检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

　　仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本

　　文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　NY/T 3816 热带作物病虫害监测技术规程 胡椒瘟病

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　胡椒瘟病 black pepper Phytophthora foot rot

　　由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的胡椒卵菌病害，又称胡椒基腐病。

　　[来源：NY/T 3816—2020，2.1，有修改]

　　聚合酶链式反应 polymerase chain reaction，PCR

　　先高温变性，使模板DNA成为单链;接着降温退火，使单链与引物通过碱基互补进行结合;再中温

　　延伸，在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使新链沿引物方向合成延伸;然后循环

　　扩增，通过多次重复变性、退火和延伸过程使靶标片段以几何倍数扩增。

　　[来源：NY/T 2252—2012，2.3，有修改]

　　4 原理

　　三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Ypt1)在疫霉属(Phytophthora)的物种间存在丰富的变异，而在

　　物种内却高度保守，可以为疫霉菌的PCR检测提供理想的靶序列。根据胡椒瘟病病原菌Ypt1设计特异性

　　引物进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期230 bp的DNA片段，判断样品中是否携带胡椒瘟病病原菌。

　　5 器材与试剂

　　主要器材

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　　组织研磨器、台式离心机、冰箱、PCR 检测仪、电泳仪、凝胶成像仪、冰箱、剪刀、镊子、样品

　　密封容器、1.5 mL离心管、研磨杵、可调量程移液器(0.1 μL～2.5 μL，0.5 μL～10 μL，10 μL～

　　100 μL，100 μL～1 000 μL)、吸头、0.2 mL PCR管等，其中接触样品的器材应是洁净无菌的。

　　主要试剂

　　5.2.1 通用要求/试剂纯度等级

　　除另有规定外，所有试剂的纯度均为分析纯或生化试剂。实验室用水应符合 GB/T 6682 要求。

　　5.2.2 DNA 提取试剂

　　推荐使用一步法DNA提取缓冲液，配制方法为：在900 mL ddH2O水中加入1.46 g 氯化钠、2.42 g 三

　　羟甲基氨基甲烷(Tris)、20 g 聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)、0.73 g 乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5 g 十

　　二烷基硫酸钠(SDS)，用1 mol/L盐酸调整pH至8.0，定容至1 000 mL。室温保存。

　　可选择植物或真菌DNA提取试剂或试剂盒。

　　5.2.3 PCR 反应试剂

　　见表1，或采用同类型的PCR 扩增试剂或试剂盒。其中PCR 引物的序列如下：

　　上游引物：5’-GACGTTTTAGTTAGAGCAC-3’;

　　下游引物：5’-AATGGCACTGAAGTTCTG-3’。

　　5.2.4 凝胶检测试剂

　　琼脂糖、Tris-乙酸(TAE)缓冲液(40 mmol/L Tris-乙酸，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)、上样缓冲

　　液(loading buffer)、DNA 分子量Marker、GoldView 或同类核酸染料。

　　6 检测方法

　　样品采集

　　按照NY/T 3816 的相关规定进行田间诊断，对于带有疑似胡椒瘟病症状的植株，选择病健交界部

　　位采集长度为5 cm～10 cm的病蔓，或者整片病叶;对于未表现症状的胡椒植株，随机采集离地表20 cm

　　内的叶片5片。样品应放入密闭容器内，室温存放时间不宜超过48 h，长期保存应置于 -70 ℃及以下温

　　度环境。取样信息填入表A.1。

　　DNA 提取

　　取30 mg～50 mg病健交界处组织或叶片，剪碎后放入1.5 mL的离心管中。加入500 μL DNA提取缓冲

　　液，用组织研磨器研磨成匀浆。10 000×g离心2 min，将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，即为DNA模

　　板。冷藏贮存不宜超过3 h，长期保存应置于-20 ℃及以下温度环境。

　　PCR 反应

　　6.3.1 PCR 反应体系

　　PCR反应体系按照表1的规定配制，或采用同类型的试剂及试剂盒依照产品说明书配制。以胡椒瘟病

　　叶片提取的DNA为阳性对照，以健康胡椒叶片提取的DNA为阴性对照，以无菌ddH2O为空白对照。

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　　表1 PCR 反应体系

　　名称 用量(μL)

　　10×PCR缓冲液(Mg2+ Free) 2.5

　　25 mmol/L MgCl2 2.5

　　dNTPs(各2.5 mmol/L) 2.0

　　10 μmol/L上游引物 0.5

　　10 μmol/L下游引物 0.5

　　Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.25

　　DNA 1.0

　　无菌ddH2O 补足至25

　　6.3.2 PCR 扩增程序

　　94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环;72 ℃延伸7 min。

　　PCR 产物检测

　　用TAE电泳缓冲液制备1%的琼脂糖凝胶,按比例将loading buffer和PCR产物混匀后加至样品孔中,

　　用 DNA Marker 做分子量的标记，进行电泳分析，电泳结束后，在凝胶成像仪下观察是否扩增出230 bp

　　的DNA电泳条带，拍照记录实验结果。

　　7 结果判定

　　根据PCR产物凝胶电泳图中是否出现230 bp条带判定检测结果。检测结果仅在阳性对照出现目的条

　　带且阴性对照、空白对照均未出现目的条带时有效。若泳道出现目的条带则判定结果为阳性，代表该样

　　品携带胡椒瘟病病原菌;若泳道未出现目的条带则判定结果为阴性，代表该样品不携带胡椒瘟病病原菌。

　　8 结果记录与档案保存

　　检测结果填入表A.1.

　　PCR产物凝胶电泳图和表A.1等档案保存1年。

　　9 样品处置

　　阳性样品应保存90 d，以备复核。保存期满后须进行灭活处理。

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　　A

　　A

　　附录A

　　(资料性)

　　胡椒瘟病病原菌分子检测报告表

　　胡椒瘟病病原菌分子检测报告表见表A.1。

　　表A.1 胡椒瘟病病原菌分子检测报告表

　　送检日期 采样日期

　　送检人 采样地点

　　联系电话 样品数量

　　送检单位 收样人

　　检测方法：

　　检测结果：

　　备注：

　　检测人(签名)：

　　审核人(签名)：

　　检测单位(盖章)：

　　年 月 日

　　注：本单一式两联，第一联送检单位存档，第二联检测单位存档。

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　　5

　　B

　　B

　　附录B

　　(资料性)

　　PCR 产物电泳图谱

　　PCR产物凝胶电泳图谱见图B.1。

　　标引序号说明：

　　M——DNA Marker;

　　1——阳性对照;

　　2——阴性对照;

　　3——空白对照;

　　4～6——阳性;

　　7～8——阴性。

　　图B.1 PCR 产物电泳图谱

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　　参考文献

　　[1] NY/T 2252—2012 槟榔黄化病病原物分子检测技术规范

　　[2] NY/T 3816-2020 热带作物病虫害监测技术规程 胡椒瘟病