DB43/T 3133-2024 水稻核辐射靶向基因突变筛选技术规程
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- 标准类型：食品地方标准
- 标准语言：中文版
- 文件类型：PDF文档
- 更新时间：2025-06-06
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资料介绍
以下是对《DB43/T 3133-2024 水稻核辐射靶向基因突变筛选技术规程》核心内容的详细总结：
一、适用范围
适用于利用核辐射诱变水稻种子，通过分子杂交与高通量测序技术筛选靶向基因突变体的操作流程。
二、核心原理
- 诱变处理：用核辐射（α粒子、β粒子、γ射线等）处理水稻干种子，诱导基因突变。
- 群体构建：种植M₁代混收种子，获得M₂代群体作为诱变库。
- 靶向筛选：
- 将M₂代单株分组（100株/池）提取混合DNA。
- 设计靶基因探针，与DNA文库杂交捕获目标片段。
- 磁珠富集后测序，筛选含突变的混池。
- 对阳性混池内单株进行靶基因测序，鉴定突变单株。
三、关键操作步骤
1. 材料准备
- 水稻种子：符合GB/T 4404.1的纯系自交品种。
- 诱变源类型：γ射线、离子束（¹²C⁶⁺）、电子束、中子、质子等。
- 最适辐射剂量：
诱变源 剂量范围 γ射线 300–350 Gy ¹²C⁶⁺离子束 120–150 Gy 电子束 300–350 Gy 中子 12–20 Gy 质子 150–200 Gy
2. 诱变群体构建
- M₁代：多本粗插，混收种子。
- M₂代：单本移栽（大田）或水培（实验室）。
3. DNA混池制备
- 取样：每100个M₂单株为1组，用5–7 mm打孔器取各单株叶片混合。
- DNA提取：使用植物基因组提取试剂盒。
4. 靶向基因筛选流程
| 步骤 | 关键操作 |
|---|---|
| 探针设计 | 覆盖靶基因所有外显子，长度80–130 bp。 |
| DNA文库构建 | 片段化DNA→加A尾→连接测序接头→PCR扩增（反应体系见附录A.1–A.3）。 |
| 分子杂交 | 探针与文库杂交（试剂：杂交洗脱试剂盒，体系见附录A.4）。 |
| 靶片段富集 | 磁珠富集杂交产物（缓冲液体系见附录A.5）。 |
| 富集产物扩增 | PCR扩增（程序：98℃ 20s→60℃ 15s→72℃ 15s，14循环，体系见附录A.6）。 |
| 突变混池筛选 | MiniSeq 500平台测序，生物信息学分析识别变异混池。 |
| 突变单株鉴定 | 设计靶基因引物，对阳性混池内单株PCR扩增+Sanger测序（体系见附录A.7）。 |
5. 编号规则
- 诱变株系：
品种名-诱变源-年月-世代-株系号（例：XX-γ射线-2023-M2-0001）。 - M₂混池：
A1.2.3...（A表示混池，数字为编号）。 - 突变单株：
A1-1...（混池编号-单株序号）。
6. 突变体档案管理
记录田间/实验室表型数据，包括：
| 品种名 | 诱变源 | 编号 | 播种期 | 始穗期 | 齐穗期 | 成熟期 | 突变基因分子特征 | 突变表型特征 ||--------|--------|------|--------|--------|--------|--------|------------------|--------------|| ... | ... | ... | ... | ... | ... | ... | ... | ... |四、仪器与试剂
- 关键设备：组织研磨仪、PCR仪、MiniSeq 500测序仪、电泳系统等。
- 试剂盒：DNA提取、文库构建、杂交捕获、测序试剂盒等。
- 磁珠：Serapure磁珠（用于富集）。
五、附录内容
提供各步骤详细反应体系及程序（如DNA片段化、接头连接、杂交条件等），确保实验可重复性。
六、归口与起草单位
- 提出单位：湖南省农业农村厅。
- 归口单位：湖南省农业标准化技术委员会。
- 起草单位：湖南省核农学与航天育种研究所、华智生物技术有限公司。
总结：该规程系统规范了从辐射诱变→群体构建→靶向基因杂交捕获→突变体筛选→档案管理的全流程，重点强调分子探针设计、DNA混池策略及高通量测序技术的应用，为水稻定向育种提供标准化技术支撑。