QB/T 8139-2025 饮料中维生素B12的测定 高效液相色谱法

　　ICS 67.050CCSX04

　　中华人民共和国轻工行业标准

　　QB/T 8139-2025

　　饮料中维生素B12 的测定 高效液相色谱法

　　DeterminationofvitaminB12inbeverages—Highperformance

　　liquid chromatography

　　2025-04-10发布2025-11-01实施

　　中华人民共和国工业和信息化部 发布

　　前言

　　本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　本文件由中国轻工业联合会提出。

　　本文件由全国食品工业标准化技术委员会(SAC/TC64)归口。

　　本文件起草单位：广东省食品工业研究所有限公司(国家轻工业食品质量监督检测广州站)、捷通(广州)检测技术服务有限公司、山西和耀科技有限公司、东鹏饮料(集团)股份有限公司、江苏广海检验检测有限公司、绿城农科检测技术有限公司、东莞市南北检测认证技术有限公司、拜发分析系统销售(北京)有限公司、翁源广业清怡食品科技有限公司。

　　本文件主要起草人：林丹、刘春丽、顾秀英、胡海娥、段文华、何焜鹏、何晓军、贺丽丽、贝荣廷、范康福、谢颖君、段凯耀、李学莉、陈俊辉、吴凯薇、蓝方存、李柳基、区玉芳、陈奇、李嘉鸿、冯志强、曾健莹、刘文剑。

　　本文件为首次发布。

　　饮料中维生素B12 的测定 高效液相色谱法

　　1范围

　　本文件描述了饮料中维生素B12的高效液相色谱测定方法。

　　本文件适用于饮料(不含动物源性成分)中维生素B12含量的测定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4原理

　　试样中维生素B12经免疫亲和柱净化、富集后，采用液相色谱仪分离检测，外标法定量。

　　5 试剂和材料

　　除另有说明外，本方法所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。

　　5.1试剂

　　5.1.1甲醇(CH3OH)：色谱纯。

　　5.1.2乙醇(C2H6O)：色谱纯。

　　5.1.3 氢氧化钠(NaOH)。

　　5.1.4 磷酸(H3PO4)。

　　5.1.5 三氟乙酸(CF3COOH)。

　　5.1.6乙酸钠(CH3COONa)。

　　5.2 标准物质

　　维生素B12标准物质(CAS号：68-19-9)：纯度不小于99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

　　5.3 试剂配制 5.3.1 氢氧化钠溶液(1 mol/L)：称取4.0 g 氢氧化钠于烧杯中，加适量水溶解后，转移至100 mL 容量瓶中，用水稀释并定容。

　　5.3.2 磷酸溶液(0.05%，体积比)：移取0.5 mL 磷酸于1000 mL 容量瓶中，用水稀释并定容。超声10 min备用。

　　5.3.3 三氟乙酸溶液(0.04%，体积比)：量取500 mL 水，加入200 μL 三氟乙酸，混匀。

　　5.3.4 乙酸钠缓冲液(0.25 mol/L)：称取20.5 g 无水乙酸钠，用950 mL 水溶解并用乙酸调pH 至4.0±0.1，用水稀释并定容至1 000 mL容量瓶中。

　　5.3.5 维生素B12 标准储备液(1 mg/mL)：准确称取维生素B12 标准物质(5.2)10mg(精确至0.000 01 g)于10 mL 棕色容量瓶，用乙醇溶解并定容至刻度线，摇匀转移至棕色试剂瓶，于-20 ℃下避光保存。有效期6 个月。

　　5.3.6 维生素B12 中间液(1 000 ng/mL)：移取维生素B12标准储备液(5.3.5)0.05 mL于50 mL 棕色容量瓶中，用水定容至刻度线。有效期1 周。

　　5.3.7 维生素 B12标准工作液：分别移取适量维生素 B12中间液(5.3.6)用水逐级稀释成质量浓度为

　　10 ng/mL，20 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL，300 ng/mL，500 ng/mL的标准工作液，现用现配。

　　5.4 材料

　　5.4.1 滤膜：0.22 μm，0.45μm 水相。

　　5.4.2 免疫亲和净化柱：维生素B12免疫亲和柱(ESAI-EXTRACT®VITAMIN B12)1)或性能相当(柱容量及柱回收满足附录A)。

　　5.4.3 玻璃纤维滤膜。

　　5.5 仪器和设备

　　5.5.1 高效液相色谱仪：带紫外或二极管阵列检测器。

　　5.5.2 电子分析天平：感量0.001g和0.00001g。

　　5.5.3 超声波清洗仪：温度范围10 ℃~80 ℃。

　　5.5.4 涡旋混合器：最高转速不低于500 r/min。

　　5.5.5 氮吹仪：气体流量不低于1 L/min。

　　6 测定步骤

　　6.1 试样制备

　　6.1.1 液体饮料

　　取多个预包装的饮料样品直接均匀混合(碳酸饮料超声10 min，去除CO2，备用)。

　　6.1.2固体饮料

　　样品需粉碎、研磨并搅拌均匀，称取10g～25g(精确至0.001g)样品，用适量水溶解，转移至500 mL 棕色容量瓶，并用水定容至刻度，备用。

　　6.2 提取与净化

　　6.2.1 提取

　　1) 给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可以使用这些等效的产品。 6.2.1.1 液体饮料

　　称取6.1.1中50 g(精确至0.001 g)或准确吸取50 mL试样(6.1.1)于100 mL比色管中。用氢氧化钠溶液(5.3.1)调整pH至5～7，涡旋混匀、过玻璃纤维滤膜、待净化。操作过程应避光操作。

　　6.2.1.2固体饮料

　　称取6.1.2中50 g(精确至0.001 g)或准确吸取50 mL试样(6.1.2)于100 mL比色管中。用氢氧化钠溶液(5.3.1)调整pH至5～7，涡旋混匀、过玻璃纤维滤膜、待净化。操作过程应避光操作。

　　6.2.2 净化

　　将免疫亲和柱连接至固相萃取装置上，弃去免疫亲和柱内的缓冲液后，将(6.2.1)试样全部样液过柱(其中含维生素B12为10 ng～500 ng)，调节过柱速度为2mL/min～3 mL/min。待样液完全过柱后，用10 mL水以稳定流速淋洗免疫亲和柱，抽干。在免疫亲和柱下放置10 mL玻璃比色管，用3 mL甲醇分3次洗脱，收集全部洗脱液，在40℃以下用氮气流缓缓吹至近干，用磷酸溶液(5.3.2)定容至1.0mL，涡旋30 s溶解残留物，0.22 μm水相滤膜过滤，待测。操作过程应避光操作。

　　6.3 色谱参考条件

　　6.3.1 色谱柱：C18(4.6mm×250mm，5 µm)，或具有同等性能的色谱柱。

　　6.3.2 流速：1 mL/min。

　　6.3.3 柱温：30 ℃。

　　6.3.4 进样体积：100 µL。

　　6.3.5 检测波长：361 nm。

　　6.3.6 流动相：流动相A 为0.05%磷酸溶液，流动相B 为甲醇，梯度洗脱见表1。

　　表1 梯度洗脱

　　时间/min 流动相A/(%) 流动相B/(%) 0 90 10 4 90 10 9 35 65 15 0 100 20 90 10 23 90 10

　　7测定

　　将维生素B12标准工作溶液(5.3.7)和试液(6.2.2)注入色谱柱，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量测定。标准溶液色谱图和试样色谱图见附录B。

　　8空白试验

　　不称取试样,按样品分析步骤操作,不应含有干扰待测组分的物质。 9 结果计算和表述

　　试样中维生素B12的含量按公式(1)计算：

　　X =׃ …………………………(1)

　　式中：

　　X——试样中维生素B12的含量，单位为微克每一百克或微克每一百毫升(μg/100 g或μg/100 mL);

　　ρ——试液色谱峰对应的维生素B12质量浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL);

　　V——定容体积，单位为毫升(mL);

　　m——样品称样量或吸取量(g或mL);

　　ƒ——试样稀释的倍数。

　　1 000——换算系数;

　　100——换算系数。

　　计算结果保留三位有效数字。

　　10精密度

　　在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不应超过其算术平均值的10%。

　　11 方法检出限和定量限

　　本方法检出限为0.02 μg/100 g;定量限为0.06 μg/100 g。

　　附录A

　　(资料性)

　　免疫亲和柱参考验证方法

　　A.1 柱容量验证

　　准确吸取4.00mL质量浓度为1 μg/mL维生素B12标准工作液至50 mL棕色容量瓶中用乙酸钠缓冲溶液(0.25 mol/L，pH=4.0±0.1)定容至刻度，摇匀。取10 mL试样过免疫亲和柱，经上样、淋洗、洗脱,收集洗脱液，在60 ℃用氮气缓缓吹至近干，用0.04%三氟乙酸溶液溶解并定容至10 mL，0.45 μm水相滤膜过滤,按本文件中色谱条件测定滤液中维生素B12的质量浓度。

　　结果要求：同一批次，3根免疫亲和柱重复试验，维生素B12的测定值均≥68ng/mL，为可使用商品。

　　A.2 柱回收率验证

　　准确吸取2.00 mL质量浓度为1μg/mL维生素B12标准工作液至50 mL棕色容量瓶中，用乙酸钠缓冲溶液(0.25 mol/L，pH=4.0±0.1)定容至刻度，摇匀。取10 mL试样过免疫亲和柱，经上样、淋洗、洗脱，收集洗脱液在60℃用氮气缓缓吹至近干，用0.04%三氟乙酸溶液溶解并定容至5mL，0.45μm水相滤膜过滤，按本文件中的色谱条件测定滤液中维生素B12的质量浓度。

　　结果要求：同一批次，3根免疫亲和柱重复试验，滤液中维生素B12的测定值均≥68 ng/mL，即回收率≥85%，为可使用商品。

　　附录B

　　(资料性)

　　色谱图

　　B.1 标准溶液色谱图见图B.1。

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　　图B.1 标准溶液色谱图

　　B.2 试样色谱图图B.2。

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　　图B.2 试样色谱图