QB/T 8140-2025 发酵液中麦角硫因的测定 高效液相色谱法

　　ICS 67.180.20CCSX69

　　中华人民共和国轻工行业标准

　　QB/T 8140-2025

　　发酵液中麦角硫因的测定 高效液相色谱法

　　Determination of ergothione in fermentation broth—High performance liquid

　　chromatography method

　　2025-04-10发布2025-11-01实施

　　中华人民共和国工业和信息化部 发布

　　前言

　　本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　本文件由中国轻工业联合会提出。

　　本文件由全国食品工业标准化技术委员会(SCA/TC64)归口。

　　本文件起草单位：国珍健康科技(北京)有限公司、安徽旭辰生物科技有限公司、浙江华睿生物技术有限公司、华熙生物科技股份有限公司、江南大学、中国生物发酵产业协会、天津科技大学、福建师范大学、中轻食品工业管理中心。

　　本文件主要起草人：关丹、张丽梅、束震、化春光、陆震、惠人杰、谢希贤、柯崇榕、杨晓明、侯思远、邢岩、李颖、王玥、任月辉。

　　本文件为首次发布。

　　发酵液中麦角硫因的测定 高效液相色谱法

　　1范围

　　本文件描述了麦角硫因发酵液中麦角硫因含量测定的高效液相色谱法。

　　本文件适用于麦角硫因发酵液中麦角硫因含量的测定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　发酵液 fermentation broth

　　将微生物菌种接入液体培养基中，在适当条件下，经过一段时间的培养，微生物菌种利用培养基中的营养成分进行代谢活动，最终形成的包含菌体、代谢产物以及未被利用的培养基成分的液体。

　　3.2

　　发酵清液 fermented clear liquid

　　发酵液(3.1)通过离心或过滤等分离手段去除细胞、菌体和其他悬浮颗粒后得到的液体。3.3

　　发酵菌体 bacterial cells

　　发酵液(3.1)经离心或过滤后的沉淀部分，为发酵液中的微生物细胞。

　　4原理

　　试样中的麦角硫因经热水提取或直接稀释，定容过滤后，利用高效液相色谱仪经亲水反相色谱柱分离后，用紫外检测器检测，外标法定量。

　　5 试剂和材料

　　5.1 水：GB/T 6682，一级水。

　　5.2乙腈：色谱纯。

　　5.3 乙腈溶液：量取乙腈3 mL，加水至100mL。

　　5.4 麦角硫因标准品(C9H15N3O2S，CAS：497-30-3)：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。 5.5 麦角硫因标准储备液(1.0 mg/mL)：称取麦角硫因标准品0.1 g，精确至0.0001g，加水溶解并定容至100 mL，0 ℃~4 ℃冷藏保存，有效期3 个月。

　　5.6 麦角硫因标准系列工作液：分别移取麦角硫因标准储备液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，分别加水定容至100mL，混匀。麦角硫因标准系列工作液的质量浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL。0℃~4℃冷藏保存，临用现配。

　　6 仪器和设备

　　6.1 分析天平：感量为0.0001 g 和0.00001 g。

　　6.2 具塞锥形瓶：150 mL。

　　6.3 水浴恒温磁力搅拌器：20 ℃~100 ℃可调，搅拌转速50 r/min～500 r/min可调。

　　6.4 离心管：10 mL。

　　6.5 离心机：转速500 r/min～5000 r/min 可调。

　　6.6 微孔滤膜：0.22 μm，水相。

　　6.7 高效液相色谱仪：配紫外检测器。

　　7分析步骤

　　7.1 试样溶液的制备

　　7.1.1 发酵液

　　量取充分混匀的发酵液1mL置于150 mL具塞锥形瓶中，加水至约60 mL，制成菌体悬液。置于95℃水浴中，以200r/min转速搅拌提取30min后，冷却至室温，将该提取液加水定容至100mL，摇匀，微孔滤膜过滤。此提取液应经适当的稀释，使麦角硫因质量浓度在标准曲线范围内。

　　7.1.2 发酵清液

　　量取充分混匀的发酵液适量置于10 mL离心管中，5 000 r/min离心10 min后，吸取上清液1mL置于100mL容量瓶中，用水定容至100mL，摇匀，微孔滤膜过滤。此发酵清液的麦角硫因质量浓度应在标准曲线范围内。

　　7.1.3 发酵菌体

　　量取充分混匀的发酵液1mL置于10 mL离心管中，5 000 r/min离心10 min后倒出上清液，用约60mL水将离心管中剩余的菌体完全洗入150 mL具塞锥形瓶中，制成菌体悬液。将菌体悬液置于95℃水浴中，以200 r/min转速搅拌提取30 min后，释放细胞内麦角硫因，冷却至室温，将该提取液加水定容至100 mL，摇匀，用微孔滤膜过滤。此提取液应经适当的稀释，使麦角硫因质量浓度在标准曲线范围内。

　　7.2 液相色谱参考条件

　　7.2.1 色谱柱：SB-Aq，250 mm×4.6mm×5 μm，或等效的亲水柱。

　　7.2.2 柱温：30 ℃。

　　7.2.3 检测波长：257 nm。

　　7.2.4 流动相：乙腈溶液。

　　7.2.5 流速：0.7 mL/min。

　　7.2.6 进样量：10 μL。 7.3 标准曲线的制作

　　将麦角硫因标准系列工作液，按质量浓度由低到高的顺序分别注入液相色谱仪中，测得相应的色谱峰面积，以标准系列工作液中麦角硫因的质量浓度为横坐标，以对应麦角硫因的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。麦角硫因标准溶液(10 μg/mL)液相色谱图见附录A中图A.1。

　　7.4 试样溶液的测定

　　将试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测溶液中麦角硫因的含量。

　　7.5 分析结果的表述

　　发酵液中麦角硫因的含量按公式(1)进行计算：

　　Xi=×f …………………………(1)

　　式中：

　　Xi——发酵液中麦角硫因的含量，单位为克每升(g/L);

　　c——标准曲线得到的试样溶液中麦角硫因的质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);

　　100——试样定容的体积，单位为毫升(mL);

　　f——提取液的稀释倍数;

　　V——量取发酵液的体积，单位为毫升(mL);

　　1 000——换算系数。

　　试验结果以平行测定结果的算术平均值表示，计算结果保留三位有效数字。

　　8 精密度

　　在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。

　　9其他

　　当发酵液量取1mL时，方法的检出限为0.6 μg/mL，定量限为2.0 μg/mL。

　　附录A

　　(资料性)

　　麦角硫因标准溶液(10μg/mL)液相色谱图

　　麦角硫因标准溶液(10 μg/mL)液相色谱图见图A.1。

　　图A.1 麦角硫因标准溶液(10μg/mL)液相色谱图