NY/T 4686-2025 直接饲喂微生物和发酵制品类饲料添加剂生产菌株 细菌菌种鉴定 分子生物学方法
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- 标准类型：农牧渔类
- 标准语言：中文版
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- 更新时间：2025-05-23
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资料介绍
中华人民共和国农业行业标准 NY/T 4686-2025 主要内容总结
1. 标准适用范围
- 针对直接饲喂微生物饲料添加剂（如活菌制剂）和发酵制品类饲料添加剂（如氨基酸、酶制剂等）的生产菌株。
- 提供两种分子生物学鉴定方法：
- 平均核苷酸一致性（ANI）鉴定法：适用于已批准或拟申报的菌种鉴定，通过全基因组测序与近缘模式菌株比对。
- 基因序列鉴定法：适用于附录A所列菌种（如枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌等），基于16S rRNA、gyrB、pheS等基因序列分析。
2. 规范性引用文件
- 引用GB/T 8170（数值修约）、GB 19489（实验室安全）、GB/T 27403（质量控制）、GB/T 37874（核酸提取）等标准，确保实验合规性。
3. 关键术语与定义
- 直接饲喂微生物饲料添加剂：直接添加到饲料或动物体内的活微生物。
- 发酵制品类饲料添加剂：微生物代谢产物经加工制成的添加剂。
- 测序深度：基因组中单个核苷酸被检测的次数（≥50×为合格）。
- 叠连群（Contig）：测序后组装的无缺失DNA片段，要求数量≤500个。
4. 试剂与仪器
- 试剂：基因组DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂、特异性引物（如16S rRNA引物27F/1492R）、阳性对照菌株（枯草芽孢杆菌CICC 10498T、嗜酸乳杆菌CICC 6096T）。
- 仪器：高通量测序仪、PCR仪、核酸电泳设备、生物安全柜等，需符合GB 19489安全标准。
5. ANI鉴定法流程
- DNA提取与质控：提取菌株基因组DNA，确保纯度、浓度符合要求。
- 全基因组测序：使用二代或三代测序技术，获得框架图或完成图，质控标准：
- 测序深度≥50×
- Contig数量≤500个
- 基因组总长度与近缘种差异≤20%
- ANI分析：
- 通过16S rRNA初步筛选近缘种（相似性>98.65%）。
- 下载近缘模式菌株基因组，计算ANI值。
- 结果判定：
- ANI>96%：鉴定为同种。
- ANI<95%：非已知种。
- 95%~96%：需结合表型或数字DNA杂交验证。
6. 基因序列鉴定法流程
- 16S rRNA基因分析：
- PCR扩增约1500 bp片段，电泳确认。
- 测序后与数据库比对，构建系统发育树。
- 相似性>98.65%且位于同一分支判定为同种。
- 辅助基因分析（gyrB/pheS）：
- 当16S rRNA无法鉴定时，扩增gyrB（约1200 bp）或pheS（约450 bp）。
- 相似性>97%且系统发育一致判定为同种。
- 适用菌种：附录A分类列出：
- 仅需16S rRNA：凝结魏茨曼氏菌、动物双歧杆菌等。
- 需16S+gyrB：枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌等。
- 需16S+pheS：干酪乳酪杆菌、嗜热链球菌等。
7. 结果报告要求
- ANI法：报告菌种拉丁学名、全基因组数据、近缘种ANI值。
- 基因法：报告基因序列、相似性及系统发育树，无法鉴定时说明相似性范围。
8. 附录与参考文献
- 附录A：明确列出21种可通过基因序列法鉴定的菌种及所需基因组合。
- 参考文献：包括EFSA关于全基因组测序的要求，确保方法与国际接轨。
9. 质量控制
- 实验需在生物安全柜内进行，设置阳性/阴性对照。
- PCR扩增需电泳验证，测序数据需经软件校对。
- 系统发育树自举值≥1000次，确保分析可靠性。
10. 创新点与意义
- 首次整合ANI法与多基因序列分析，提升菌种鉴定准确性。
- 明确测序质控标准（如Contig数量、基因组长度差异），确保数据可靠性。
- 分类指导不同菌种的鉴定策略，兼顾效率与成本，适用于饲料添加剂行业监管与生产质量控制。
该标准为我国饲料微生物菌种鉴定提供了分子水平的标准化方法，推动行业规范化发展，保障添加剂安全性与有效性。