SN/T 5913-2025 进出口危险化学品 海洋鱼类胚胎急性毒性试验

　　中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

　　进出口危险化学品　海洋鱼类胚胎

　　急性毒性试验

　　Import and export of dangerous chemicals—Marine fish embryo acute

　　toxicity test

　　中华人民共和国海关总署　　发　布

　　2025‑07‑25 发布2026‑02‑01 实施

　　前言

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

　　起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。

　　本文件起草单位：中华人民共和国宁波海关技术中心、深圳市检验检疫科学研究院、宁波检验检疫科

　　学技术研究院(宁波国检贸易便利化服务中心)。

　　本文件主要起草人：刘汉伟、陈有为、邹小红、陈丹超、乐琪君、章跃龙、陈俊彬。

　　Ⅰ

　　SN/T 5913—2025

　　进出口危险化学品　海洋鱼类胚胎

　　急性毒性试验

　　1 范围

　　本文件界定了进出口危险化学品海洋鱼类胚胎急性毒性试验的术语和定义，规定了进出口危险化学

　　品海洋鱼类胚胎急性毒性试验的受试物信息、方法原理、试验准备、质量控制、数据分析和试验报告，描述

　　了相应的试验方法。

　　本文件适用于测试和评价能在水中形成均一溶液的化学品对海洋鱼类胚胎的急性毒性。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

　　件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本

　　文件。

　　GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 21845　化学品　水溶解度试验

　　GB/T 21852　化学品　分配系数(正辛醇-水)高效液相色谱法试验

　　GB/T 21853　化学品　分配系数(正辛醇-水)摇瓶法试验

　　GB/T 21855　化学品　与pH 有关的水解作用试验

　　GB/T 22052　用液体蒸气压力计测定液体的蒸气压力　温度关系及初始分解温度的方法

　　GB/T 22228　工业用化学品　固体及液体的蒸气压在10-1 Pa 至105 Pa 范围内的测定　静态法

　　GB/T 22229　工业用化学品　固体及液体的蒸气压在10-3 Pa 至1 Pa 范围内的测定　蒸气压平

　　衡法

　　OECD 化学品测试导则No.104　蒸气压(Vapour Pressure)

　　OECD 化学品测试导则No.112　水中解离常数(Dissociation Constants in Water)

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　静态试验 static test

　　以整个试验过程中试验介质不更换不流动的方式进行的试验。

　　3.2

　　半静态试验 semi‑static test

　　以定期(如24 h)更换试验介质的方式进行的试验。

　　3.3

　　半数效应浓度 concentration for 50% of maximal effect

　　EC50

　　引起50% 的鱼类胚胎死亡的受试物浓度，以EC50 表示。

　　1

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　　3.4

　　酸度系数值 acidity coefficient

　　酸离解常数

　　pKa

　　一个特定的平衡常数，代表一种酸离解氢离子的能力。

　　4 受试物信息

　　受试物的以下信息有助于试验设计：

　　a) 按照GB/T 21845 方法测定的水中溶解度;

　　b) 有机溶剂中的溶解性;

　　c) 按照GB/T 22052、GB/T 22228、GB/T 22229 或OECD 化学品测试导则No.104 方法测定的蒸

　　气压和亨利常数;

　　d) 受试物结构式;

　　e) 受试物纯度;

　　f) 按照OECD 化学品测试导则No.112 方法测定的解离常数pKa值;

　　g) 按照GB/T 21855 方法测定的水解作用;

　　h) 光解;

　　i) 按照GB/T 21852 或GB/T 21853 方法测定的正辛醇-水分配系数;

　　j) 受试物的物理性质及来源(批次、批号)。

　　5 方法原理

　　在规定的试验条件下，将海洋鱼类胚胎在不同浓度的受试物水溶液中暴露96 h，每天记录胚胎的孵

　　化和毒性反应症状，根据胚胎存活与死亡数据计算受试物的EC50 值。

　　6 试验准备

　　6.1 仪器设备

　　6.1.1 pH 计：测量范围0~14，最小分度0.1 pH 单位。

　　6.1.2 盐度计：测量范围0‰ g/1 000 g~100‰ g/1 000 g，测量精度±2‰，温度补偿范围10 ℃~40 ℃。

　　6.1.3 溶解氧测定仪：测量范围0.05 mg/L~20.0 mg/L 或1%~200% 饱和度，0 mg/L~8 mg/L 范围内

　　测量精度±0.1 mg/L 或±10%。

　　6.1.4 电子天平：量程不低于1 000 g，最小分度值0.01 g。

　　6.1.5 电子天平：量程不低于50 g，最小分度值0.1 mg。

　　6.1.6 相关化学分析仪器：如高效液相色谱仪、高效液相色谱质谱联用仪、电感耦合等离子质谱仪、气相

　　色谱仪、气相色谱质谱联用等。

　　6.1.7 恒温培养箱：20 ℃下控制精度为±1 ℃。

　　6.1.8 体视显微镜：至少可放大30 倍。

　　6.2 材料

　　6.2.1 化学惰性材料制成的鱼缸，容量应满足试验种鱼的推荐承载量。

　　2

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　　6.2.2 产卵网箱：化学惰性材料制成。

　　6.2.3 试验容器：胚胎培养板(如：标准6 孔板)。

　　6.2.4 用于覆盖胚胎培养板的盖子或封口膜。

　　6.2.5 用于收集鱼卵的宽口吸液管。

　　6.2.6 玻璃器皿：烧杯、容量瓶、结晶皿等玻璃器皿。

　　6.3 试验容器

　　使用玻璃或聚苯乙烯制成的试验容器(例如，每孔容积为2.5 mL~5 mL 的6 孔板)。若样品对聚苯

　　乙烯有吸附作用，应采用惰性材料(玻璃)制成的容器。试验容器在培养箱中的位置应随机摆放。

　　6.4 试验生物

　　6.4.1 亲鱼选择

　　挑选来源明确，有良好受精率记录的亲鱼用作产卵。产卵前，亲鱼无肉眼可观察的感染或疾病，且

　　2 个月以上未经过任何药物处理(急性或预防)。推荐使用表1 所列的鱼种，若使用其他鱼种，应列明试

　　验条件。

　　表1　推荐使用的鱼类种鱼

　　鱼种

　　黑鲷(Acanthopagrus schlegelii )

　　驯养温度/℃

　　18~22

　　光暗比(h∶h)

　　12∶12

　　饵料

　　白对虾配合饲料/丰年虾活体/冷冻红虫

　　6.4.2 亲鱼驯养条件

　　亲鱼驯养条件如下。

　　——水：人工海水，盐度20‰~30‰。

　　——光照周期：明暗比为12 h∶12 h。

　　——温度：20 ℃±2 ℃。

　　——溶解氧：≥80% 饱和值。

　　——推荐承载量：1 尾/100 L 水。

　　6.4.3 产卵

　　试验前一天将数对亲鱼按照雌雄比为1∶1(或1∶2)在产卵箱配对，受精完成后，收集水体表面鱼类受

　　精卵备用。

　　6.4.4 鱼卵的分化与选择

　　在20 ℃±2 ℃温度条件下，受精卵在约15 min 后开始第一次分裂，并且连续分裂至4、8、16 和32 细

　　胞期。采用至少可放大30 倍的体视显微镜观察，选择受精且无明显不规则分裂(例如，不对称、囊泡形

　　成)或破损的鱼卵进行试验。选择试验数目2 倍的鱼卵进行镜检，挑选出合格受精卵备用，并计算其百分

　　率。使用受精率≥70% 时亲鱼所产的鱼卵。鱼卵在受精后3 h 内暴露于试验溶液中。

　　6.5 样品处理和保存

　　6.5.1 储备液

　　电子天平称取所需质量的受试物溶于一定体积的海水中，混匀配制储备液。低水溶性物质的储备液

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　　或试验溶液可通过搅拌、超声分散或其他合适的物理方法配制。避免使用助溶剂，如有必要，应在制备母

　　液时使用，溶剂在试验溶液中的终浓度不超过0.1 mL/L，且每个试验容器中的溶剂浓度应一致。当使用

　　助溶剂时，应设助溶剂对照组。溶剂对照组应对胚胎的孵化时间和存活率无明显效应，且无其他不利

　　影响。

　　6.5.2 试验溶液

　　如果加入样品后，试验溶液的pH 有明显变化，则调节样品储备液的pH，使其接近空白对照组海水

　　的pH，但不能使样品浓度明显改变，或发生化学反应或样品沉淀。推荐使用盐酸(HCl)和氢氧化钠

　　(NaOH)调节pH。

　　7 试验

　　7.1 暴露条件

　　暴露条件包括以下内容。

　　——持续时间：96 h。

　　——光照：光暗比12 h∶12 h。

　　——温度：18 ℃~22 ℃。

　　——盐度：28‰~33‰。

　　——pH：7.6~8.2。

　　——溶解氧：不小于80% 饱和值。

　　7.2 胚胎数量

　　每个试验浓度组不少于20 只受精胚胎。

　　7.3 预试验

　　选取4 组~5 组等比或等间距浓度，如1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L 及空白对照组，每个组放置

　　10 颗受精卵进行试验，每块6 孔板均需设置板内空白对照，以确定全部死亡和存活的浓度范围。至少每

　　24 h 观察1 次胚胎死亡数和其他可观察效应;从48 h 开始，每24 h 记录1 次对照组和样品组胚胎孵

　　化数。

　　7.4 正式试验

　　根据预试验结果，在全部死亡的最低浓度与96 h 无可观察毒性效应的最高浓度之间至少设置5 个

　　浓度组(尽可能包括这两个浓度)，并以几何级数分布。浓度间隔系数应≤2.2。试验同时设置空白对照

　　组(试验用水)或/和溶剂对照组、板内质控组。至少在试验开始前24 h，对所有试验容器进行试验溶液预

　　处理。每个试验组放置20 粒胚胎，每个试验孔溶液体积为2.5 mL~5.0 mL。

　　7.5 观察

　　胚胎症状如表2 所示，如观察到表中所述表征即可判定死亡。从48 h 开始至试验结束时，每日观察

　　1 次所有样品组和对照组的孵化数。试验结束时，如板内质控死亡超过1 个，则整板无效，该浓度组应

　　剔除。

　　4

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　　表2　胚胎急性毒性试验观察终点

　　观察终点

　　卵凝结a

　　体节缺失b

　　尾部未分离c

　　无心跳d

　　a　卵凝结：凝结的胚胎呈乳白色，在显微镜下观察呈黑色，可分别在24 h、48 h、72 h 和96 h 观察。

　　b　体节缺失：在20 ℃±2 ℃条件下，正常发育的胚胎在24 h 后会形成体节。体节发育正常的胚胎会有自主运动(来

　　回收缩)，自主运动的出现可表明胚胎体节发育成型。体节缺失可分别在24 h、48 h、72 h 和96 h 观察。如暴露

　　24 h 后体节未形成，可归因于发育迟缓;如48 h 后仍未形成，可判定死亡。

　　c　尾部未分离：正常发育的胚胎，在其身体后部伸长后可观察到尾部与卵黄囊分离的现象。尾部未分离可分别在

　　24 h、48 h、72 h 和96 h 观察。

　　d　无心跳：在20 ℃±2 ℃条件下，正常发育的胚胎在48 h 后会有心跳。记录该终点时应特别注意，心率不齐或有心

　　跳但腹部无血流循环均不能判定胚胎死亡。判定胚胎无心跳，应至少在放大80 倍条件下观察持续1 分钟或以

　　上。无心跳可分别在48 h、72 h 和96 h 观察。

　　e　+：记录该症状的鱼卵数量。

　　f　-：无需记录。

　　暴露时间/h

　　24

　　+e

　　+

　　+

　　-f

　　48

　　+

　　+

　　+

　　+

　　72

　　+

　　+

　　+

　　+

　　96

　　+

　　+

　　+

　　+

　　7.6 分析测量

　　7.6.1 静态试验条件下，每24 h 测定一次受试物溶液的浓度、溶解氧、pH 和温度。

　　7.6.2 半静态试验条件下，在试验开始、每次更新前后及试验结束时测定所有试验组溶液的浓度、溶解

　　氧、pH、温度和盐度参数。

　　7.6.3 每次应至少选择3 个试验孔进行温度测定。

　　7.6.4 为获得足够体积的试验溶液进行浓度分析，各试验组设置1 个额外的平行容器用于取样，该容器

　　所有条件与试验容器完全一致(材质、溶液体积/表面积，暴露条件等，但不放胚胎)。

　　7.7 限度试验

　　当受试物毒性较低时，可进行浓度为100 mg/L(有效成分)的限度试验。每个试验组应至少放置20 粒

　　胚胎。如果受试物组胚胎死亡率超过对照组的10%，则需进行完整试验。

　　8 质量控制

　　试验达到下列要求，即有效：

　　——试验鱼胚胎总受精率≥70%;

　　——试验期间，试验容器中温度维持在20 ℃±2 ℃;

　　——试验结束时，空白对照组(溶剂对照组，若使用)胚胎存活率≥90%;

　　——试验结束时，空白对照组(溶剂对照组，若使用)胚胎孵化率≥80%;

　　——试验结束时，空白对照组和最高浓度样品组试验溶液的溶解氧含量≥80% 饱和值。

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　　9 数据分析

　　9.1 在静态或半静态试验中，采用实测浓度的几何平均值作为试验结果。

　　9.2 若无法进行溶液浓度分析，则采用配制浓度进行结果计算。

　　9.3 半静态试验中，当更新前的溶液实测浓度低于分析方法的检出限或定量限时，以1/2 检出限或定量

　　限作为该溶液的实测浓度进行计算。

　　9.4 每个试验孔作为独立平行参与统计分析。选择合适的统计软件计算出48 h 和/或96 h 的EC50 值，

　　及其95% 的置信限。

　　9.5 如果试验数据不适用标准方法计算EC50 值，可用不产生死亡的最高浓度和产生100% 死亡的最低

　　浓度估算EC50 近似值，即这两个浓度的几何平均值。

　　10 试验报告

　　试验报告应包括以下内容。

　　a) 受试物：

　　——物理性质和相关的理化特性(水溶性、在溶剂中的溶解性以及蒸汽压);

　　——化学鉴定数据：结构式、纯度、在水中和光照下的稳定性、正辛醇-水分配系数(Kow);

　　——物理外观，来源及批号。

　　b) 试验生物：

　　——种鱼学名、品系、来源;

　　——种鱼驯养水质参数(如：pH、盐度、温度、溶解氧浓度);

　　——受精卵收集方法和操作过程。

　　c) 试验条件：

　　——试验方式(如：静态、半静态);

　　——光照周期;

　　——试验设计(如：试验容器数量、对照组类型);

　　——试验期间，试验溶液中的溶解氧浓度、pH、硬度和温度等;

　　——母液和试验溶液配制方法及更新频率;

　　——试验用水，来源、类型、水质(pH、盐度和温度等);

　　——使用和选择溶剂的理由。

　　d) 试验结果和讨论：

　　——胚胎受精率;

　　——样品组及对照组的孵化率;

　　——试验期间，无死亡发生的最高浓度;

　　——试验期间，导致100% 死亡的最低浓度;

　　——24 h、48 h、72 h、96 h 时的每个浓度的累计死亡率;

　　——48 h(若有)和96 h 的EC50，及其95% 的置信限(若有);

　　——浓度-死亡率曲线图;

　　——对照组死亡率(空白对照、板内质控、及溶剂对照);

　　——4 个可观察终点的数据;

　　——形态和生理上的异常现象描述;

　　——配制浓度及试验容器中的实测浓度、样品分析方法的定量限和回收率;

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　　——确定EC50 值的统计学方法(点估计、回归模型及用于计算EC50 的几何平均值);

　　——任何相对于本文件的偏离及对试验结果的影响说明。

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