GB 4789.30-2025 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验
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资料介绍
中华人民共和国国家标准
GB4789.30—2025
食品安全国家标准
食品微生物学检验
单核细胞增生李斯特氏菌检验
2025-03-16发布2025-09-16实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会
国家市场监督管理总局发布
前 言
本标准代替GB4789.30—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏
菌检验》。
本标准与GB4789.30—2016相比,主要变化如下:
———修改了适用范围;
———修改了培养基和试剂,增加了OA 李斯特氏菌显色培养基配方;
———修改了第一法 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验增菌液、选择性培养基、检验程序、鉴定方
法等;
———修改了第二法 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法的样品接种、菌落计数和确认、结果计
数、结果报告;
———修改了第三法 单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法的样品接种。
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GB4789.30—2025
食品安全国家标准
食品微生物学检验
单核细胞增生李斯特氏菌检验
1 范围
本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的检验方法。
本标准第一法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验;第二法适用于单核细胞增生李
斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数;第三法适用于单核细胞增生李斯特氏菌
含量较低的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。
2.1 冰箱:2℃~8℃。
2.2 恒温培养箱:30℃±1℃、36℃±1℃、25℃~30℃。
2.3 均质器。
2.4 显微镜:100×~1000×。
2.5 电子天平:感量为0.1g、0.1mg。
2.6 锥形瓶:100mL、500mL。
2.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL 刻度)或移液器(量程为0.1mL、1mL、
10mL)及无菌吸头。
2.8 无菌培养皿:直径90mm。
2.9 无菌试管:16mm ×160mm。
2.10 离心机:4000r/min。
2.11 无菌离心管:30mm ×100mm。
2.12 无菌注射器:1mL。
2.13 油镜或相差显微镜。
2.14 无菌涂布棒。
2.15 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111 或CMCC54004或其他等效
菌株。
2.16 英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua)ATCC33090或其他等效菌株。
2.17 伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii)ATCC19119或其他等效菌株。
2.18 斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri)ATCC35967或其他等效菌株。
2.19 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923或其他等效菌株,要求产β-溶血环。
2.20 马红球菌(Rhodococcusequi)ATCC6939或NCTC1621或其他等效菌株。
2.21 小鼠:ICR品系,体重18g~22g。
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2.22 微生物生化鉴定系统。
2.23 无菌过滤装置。
3 培养基和试剂
3.1 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE):见附录A 中A.1。
3.2 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE):见A.2。
3.3 Fraser增菌肉汤(FB1、FB2):见A.3。
3.4 OA 李斯特氏菌显色培养基:见A.4。
3.5 PALCAM 培养基:见A.5。
3.6 革兰氏染色液:见A.6。
3.7 SIM 动力培养基:见A.7。
3.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和乙酰甲基醇(VP)试验用]:见A.8。
3.9 羊血琼脂:见A.9。
3.10 无菌磷酸盐缓冲液:见A.10。
3.11 无菌生理盐水:见A.11。
3.12 糖发酵管:见A.12。
3.13 过氧化氢试剂:见A.13。
3.14 微生物生化鉴定试剂盒。
第一法 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验
4 检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序见图1。
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GB4789.30—2025
图1 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序
5 操作步骤
5.1 增菌
以无菌操作取25g(mL)样品,置于盛有225mLFB1 增菌肉汤的无菌均质杯内,8000r/min~
10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mLFB1 增菌肉汤的无菌均质袋中,用拍击式均质器
拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。若样品为液态,也可采用振荡或搅拌混匀。于30 ℃±1 ℃
培养24h±2h。混匀,吸取0.1mLFB1 增菌肉汤,转种于10mLFB2 增菌肉汤内。于30℃±1℃培
养24h±2h。
5.2 分离
取混匀后的FB2 增菌肉汤,分别接种于OA 李斯特氏菌显色培养基(或其他等效李斯特氏菌显色
培养基)平板和PALCAM 培养基平板,36℃±1℃ 培养24h~48h,观察各个平板上生长的菌落。典
型菌落在OA 李斯特氏菌显色培养基平板上形成直径为1mm~3mm 的圆形蓝绿色菌落,周围有不透
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GB4789.30—2025
明的晕圈。典型菌落在PALCAM 培养基平板上形成直径为1mm~3mm 的圆形灰绿色菌落,周围有
棕黑色水解圈,培养48h后,部分菌落中心形成黑点且有凹陷。其他等效李斯特氏菌显色培养基平板
上的菌落特征参照产品说明进行判定。
注1:一些单核细胞增生李斯特氏菌在OA李斯特氏菌显色培养基上的菌落周围的晕圈不明显甚至没有晕圈。还
有一些单核细胞增生李斯特氏菌在OA李斯特氏菌显色培养基上的菌落周围的晕圈出现得比较迟缓,有时
需要4d以上才出现。
注2:伊氏李斯特氏菌在OA李斯特氏菌显色培养基上的菌落形态与单核细胞增生李斯特氏菌相似。
5.3 纯培养
从每个平板(符合5.2要求的平板)中挑取3个~5个典型或可疑菌落(少于3个全选),在TSA-YE
平板或羊血平板上划线,于36℃±1℃培养18h~24h。单核细胞增生李斯特氏菌在TSA-YE平板或
羊血平板上,呈灰白色,半透明,边缘整齐,露滴状菌落、直径为1mm~2mm。
5.4 初步鉴定
挑取TSA-YE平板或羊血平板上的单个菌落,接种木糖、鼠李糖发酵管,于36℃±1℃培养24h±
2h;同时在TSA-YE平板或羊血平板上划线,于36℃±1℃培养18h~24h,以获取下一步鉴定用的
纯培养物。然后选择木糖阴性,鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。
5.5 鉴定
注:可先从每个平板(符合5.2要求的平板)中挑取1株菌进行鉴定试验,如果鉴定为单核细胞增生李斯特氏菌,可
直接按6结果与报告的规定报告检出结果;按5.3要求挑取的3个~5个典型或可疑菌落(少于3个全选)均鉴
定为非单核细胞增生李斯特氏菌后方可报告未检出的结果。
5.5.1 镜检:挑取18h~24h纯培养的单个菌落做革兰氏染色镜检,李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌,
大小为(0.4μm~0.5μm)×(0.5μm~2.0μm)。用生理盐水制成菌悬液,在油镜或相差显微镜下观察,
该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
5.5.2 动力试验:挑取18h~24h纯培养的单菌落穿刺半固体或SIM 动力培养基,于25℃~30℃培
养48h±2h。李斯特氏菌沿穿刺线以不规则的云雾状向四周延伸生长,培养基表面下3mm~5mm
处形成一似伞状(或梭状)界面。如伞状(或梭状)生长不明显,可继续培养,每天观察结果1次,观察
5d。
5.5.3 生化鉴定:挑取18h~24h纯培养的单个菌落,进行过氧化氢酶试验,过氧化氢酶阳性反应的菌
落继续进行糖发酵试验、MR-VP试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。
5.5.4 溶血试验:将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为20个~25个小格,挑取18h~24h纯培养的单个
菌落刺种到血平板上,每格刺种1个菌落,并刺种阳性对照菌(单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏
菌和斯氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌),穿刺时尽量接近底部,但不要触到底面,同时
避免琼脂破裂,36℃±1℃ 培养24h~48h,于明亮处观察,单核细胞增生李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、
明亮的溶血圈,斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭窄、微弱的溶血环,英诺克李斯特氏菌无溶血环,伊
氏李斯特氏菌产生宽的、轮廓清晰的β-溶血区域。
5.5.5 协同溶血试验CAMP(可选项目):在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球
菌,挑取18h~24h纯培养的单个菌落垂直划线接种于平行线之间,垂直线两端不要触及平行线,距离
1mm~2mm,同时接种单核细胞增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特
氏菌,于36℃±1℃培养24h~48h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约
2mm 的β-溶血增强区域,斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域,伊氏李斯特氏菌在靠近马红球
菌处出现5mm~10mm 的“箭头状”β-溶血增强区域,英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象。若结果不
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GB4789.30—2025
明显,可置2℃~8℃ 冰箱24h~48h再观察。
注:有5%~8% 的单核细胞增生李斯特氏菌可在马红球菌一端形成轻微溶血增强(约1mm)现象,此现象不属于
溶血增强的情况。
表1 单核细胞增生李斯特氏菌主要鉴定特征及与其他李斯特氏菌的区别
菌种木糖鼠李糖葡萄糖麦芽糖甘露醇七叶苷MR-VP 溶血试验
单核细胞增生李斯特氏菌
(L.monocytogenes) - + + + - + +/+ +
格氏李斯特氏菌
(L.grayi) - - + + + + +/+ -
斯氏李斯特氏菌
(L. seeligeri) + - + + - + +/+ +
威氏李斯特氏菌
(L.welshimeri) + V + + - + +/+ -
伊氏李斯特氏菌
(L. ivanovii) + - + + - + +/+ +
英诺克李斯特氏菌
(L. innocua) - V + + - + +/+ -
部分单核细胞增生李斯特氏菌不溶
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单核细胞增生李斯特氏菌检验
2025-03-16发布2025-09-16实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会
国家市场监督管理总局发布
前 言
本标准代替GB4789.30—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏
菌检验》。
本标准与GB4789.30—2016相比,主要变化如下:
———修改了适用范围;
———修改了培养基和试剂,增加了OA 李斯特氏菌显色培养基配方;
———修改了第一法 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验增菌液、选择性培养基、检验程序、鉴定方
法等;
———修改了第二法 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法的样品接种、菌落计数和确认、结果计
数、结果报告;
———修改了第三法 单核细胞增生李斯特氏菌MPN 计数法的样品接种。
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食品安全国家标准
食品微生物学检验
单核细胞增生李斯特氏菌检验
1 范围
本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的检验方法。
本标准第一法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验;第二法适用于单核细胞增生李
斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数;第三法适用于单核细胞增生李斯特氏菌
含量较低的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。
2.1 冰箱:2℃~8℃。
2.2 恒温培养箱:30℃±1℃、36℃±1℃、25℃~30℃。
2.3 均质器。
2.4 显微镜:100×~1000×。
2.5 电子天平:感量为0.1g、0.1mg。
2.6 锥形瓶:100mL、500mL。
2.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL 刻度)或移液器(量程为0.1mL、1mL、
10mL)及无菌吸头。
2.8 无菌培养皿:直径90mm。
2.9 无菌试管:16mm ×160mm。
2.10 离心机:4000r/min。
2.11 无菌离心管:30mm ×100mm。
2.12 无菌注射器:1mL。
2.13 油镜或相差显微镜。
2.14 无菌涂布棒。
2.15 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111 或CMCC54004或其他等效
菌株。
2.16 英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua)ATCC33090或其他等效菌株。
2.17 伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii)ATCC19119或其他等效菌株。
2.18 斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri)ATCC35967或其他等效菌株。
2.19 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923或其他等效菌株,要求产β-溶血环。
2.20 马红球菌(Rhodococcusequi)ATCC6939或NCTC1621或其他等效菌株。
2.21 小鼠:ICR品系,体重18g~22g。
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2.22 微生物生化鉴定系统。
2.23 无菌过滤装置。
3 培养基和试剂
3.1 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE):见附录A 中A.1。
3.2 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE):见A.2。
3.3 Fraser增菌肉汤(FB1、FB2):见A.3。
3.4 OA 李斯特氏菌显色培养基:见A.4。
3.5 PALCAM 培养基:见A.5。
3.6 革兰氏染色液:见A.6。
3.7 SIM 动力培养基:见A.7。
3.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和乙酰甲基醇(VP)试验用]:见A.8。
3.9 羊血琼脂:见A.9。
3.10 无菌磷酸盐缓冲液:见A.10。
3.11 无菌生理盐水:见A.11。
3.12 糖发酵管:见A.12。
3.13 过氧化氢试剂:见A.13。
3.14 微生物生化鉴定试剂盒。
第一法 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验
4 检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序见图1。
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图1 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序
5 操作步骤
5.1 增菌
以无菌操作取25g(mL)样品,置于盛有225mLFB1 增菌肉汤的无菌均质杯内,8000r/min~
10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mLFB1 增菌肉汤的无菌均质袋中,用拍击式均质器
拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。若样品为液态,也可采用振荡或搅拌混匀。于30 ℃±1 ℃
培养24h±2h。混匀,吸取0.1mLFB1 增菌肉汤,转种于10mLFB2 增菌肉汤内。于30℃±1℃培
养24h±2h。
5.2 分离
取混匀后的FB2 增菌肉汤,分别接种于OA 李斯特氏菌显色培养基(或其他等效李斯特氏菌显色
培养基)平板和PALCAM 培养基平板,36℃±1℃ 培养24h~48h,观察各个平板上生长的菌落。典
型菌落在OA 李斯特氏菌显色培养基平板上形成直径为1mm~3mm 的圆形蓝绿色菌落,周围有不透
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明的晕圈。典型菌落在PALCAM 培养基平板上形成直径为1mm~3mm 的圆形灰绿色菌落,周围有
棕黑色水解圈,培养48h后,部分菌落中心形成黑点且有凹陷。其他等效李斯特氏菌显色培养基平板
上的菌落特征参照产品说明进行判定。
注1:一些单核细胞增生李斯特氏菌在OA李斯特氏菌显色培养基上的菌落周围的晕圈不明显甚至没有晕圈。还
有一些单核细胞增生李斯特氏菌在OA李斯特氏菌显色培养基上的菌落周围的晕圈出现得比较迟缓,有时
需要4d以上才出现。
注2:伊氏李斯特氏菌在OA李斯特氏菌显色培养基上的菌落形态与单核细胞增生李斯特氏菌相似。
5.3 纯培养
从每个平板(符合5.2要求的平板)中挑取3个~5个典型或可疑菌落(少于3个全选),在TSA-YE
平板或羊血平板上划线,于36℃±1℃培养18h~24h。单核细胞增生李斯特氏菌在TSA-YE平板或
羊血平板上,呈灰白色,半透明,边缘整齐,露滴状菌落、直径为1mm~2mm。
5.4 初步鉴定
挑取TSA-YE平板或羊血平板上的单个菌落,接种木糖、鼠李糖发酵管,于36℃±1℃培养24h±
2h;同时在TSA-YE平板或羊血平板上划线,于36℃±1℃培养18h~24h,以获取下一步鉴定用的
纯培养物。然后选择木糖阴性,鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。
5.5 鉴定
注:可先从每个平板(符合5.2要求的平板)中挑取1株菌进行鉴定试验,如果鉴定为单核细胞增生李斯特氏菌,可
直接按6结果与报告的规定报告检出结果;按5.3要求挑取的3个~5个典型或可疑菌落(少于3个全选)均鉴
定为非单核细胞增生李斯特氏菌后方可报告未检出的结果。
5.5.1 镜检:挑取18h~24h纯培养的单个菌落做革兰氏染色镜检,李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌,
大小为(0.4μm~0.5μm)×(0.5μm~2.0μm)。用生理盐水制成菌悬液,在油镜或相差显微镜下观察,
该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
5.5.2 动力试验:挑取18h~24h纯培养的单菌落穿刺半固体或SIM 动力培养基,于25℃~30℃培
养48h±2h。李斯特氏菌沿穿刺线以不规则的云雾状向四周延伸生长,培养基表面下3mm~5mm
处形成一似伞状(或梭状)界面。如伞状(或梭状)生长不明显,可继续培养,每天观察结果1次,观察
5d。
5.5.3 生化鉴定:挑取18h~24h纯培养的单个菌落,进行过氧化氢酶试验,过氧化氢酶阳性反应的菌
落继续进行糖发酵试验、MR-VP试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。
5.5.4 溶血试验:将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为20个~25个小格,挑取18h~24h纯培养的单个
菌落刺种到血平板上,每格刺种1个菌落,并刺种阳性对照菌(单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏
菌和斯氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌),穿刺时尽量接近底部,但不要触到底面,同时
避免琼脂破裂,36℃±1℃ 培养24h~48h,于明亮处观察,单核细胞增生李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、
明亮的溶血圈,斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭窄、微弱的溶血环,英诺克李斯特氏菌无溶血环,伊
氏李斯特氏菌产生宽的、轮廓清晰的β-溶血区域。
5.5.5 协同溶血试验CAMP(可选项目):在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球
菌,挑取18h~24h纯培养的单个菌落垂直划线接种于平行线之间,垂直线两端不要触及平行线,距离
1mm~2mm,同时接种单核细胞增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特
氏菌,于36℃±1℃培养24h~48h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约
2mm 的β-溶血增强区域,斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域,伊氏李斯特氏菌在靠近马红球
菌处出现5mm~10mm 的“箭头状”β-溶血增强区域,英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象。若结果不
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明显,可置2℃~8℃ 冰箱24h~48h再观察。
注:有5%~8% 的单核细胞增生李斯特氏菌可在马红球菌一端形成轻微溶血增强(约1mm)现象,此现象不属于
溶血增强的情况。
表1 单核细胞增生李斯特氏菌主要鉴定特征及与其他李斯特氏菌的区别
菌种木糖鼠李糖葡萄糖麦芽糖甘露醇七叶苷MR-VP 溶血试验
单核细胞增生李斯特氏菌
(L.monocytogenes) - + + + - + +/+ +
格氏李斯特氏菌
(L.grayi) - - + + + + +/+ -
斯氏李斯特氏菌
(L. seeligeri) + - + + - + +/+ +
威氏李斯特氏菌
(L.welshimeri) + V + + - + +/+ -
伊氏李斯特氏菌
(L. ivanovii) + - + + - + +/+ +
英诺克李斯特氏菌
(L. innocua) - V + + - + +/+ -
部分单核细胞增生李斯特氏菌不溶