T/WEBIO 0003-2024 人源肿瘤组织活性冻存与复苏技术规范
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资料介绍
ICS 07.080
CCS C 04
团体标准
T/WEBIO 0003—2024
人源肿瘤组织活性冻存与复苏技术规范
Technical specification for active cryopreservation and resuscitation of human tumortissue
2024 - 12 - 30 发布2024 - 12 - 30 实施
武汉东湖国家自主创新示范区生物医药行业协会 发布
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由武汉大学提出。
本文件由武汉东湖国家自主创新示范区生物医药行业协会归口。
本文件起草单位：武汉大学、中国典型培养物保藏中心、武汉赛尔朗灵科技有限公司、武汉大学细
胞资源库、中国医学科学院基础医学研究所、天津医科大学肿瘤医院肿瘤生物样本库、浙江省肿瘤医院
生物样本库、华中科技大学同济医学院、华中科技大学同济医学院附属同济医院、华中科技大学同济医
学院附属协和医院、武汉儿童医院、武汉大学人民医院、武汉亚洲心脏病医院、湖南省肿瘤医院、中南
大学湘雅医院、中南大学湘雅二医院、中南大学湘雅三医院、中南大学湘雅口腔医学院、复旦大学附属
华山医院、陆军军医大学西南医院、重庆医科大学附属第一医院、贵州医科大学附属医院、南方医科大
学皮肤病医院、湖北省医疗器械质量监督检验研究院、武汉市临床检验中心、武汉市标准化研究院。
本文件主要起草人：沈超、刘玉琴、李继新、王前进、刘霞、吴婕、杨媚媚、何静、夏司璇、王昱
东、熊君、廖聪、李南、周彩虹、李海欣、郑智国、宇兴江、胡志全、杨春光、姜晓兵、章小平、李俊
俊、肖晗、吴业帆、宋启斌、任海波、何正文、申竑、周恩相、黄菊芳、梁青春、王龙、邓智元、何雨
鸣、陈向军、冯华、李飞、贾英、任婕、杨斌、李玲、龚洁、黄勇、任雯菁。
T/WEBIO 0003—2024
1
人源肿瘤组织活性冻存与复苏技术规范
1 范围
本文件规定了人源肿瘤组织活性冻存的取样标准、冻存前预处理、深低温保存、复苏培养及质量检
测的操作程序和一般原则。
本文件适用于科研用人源肿瘤组织的活性冻存与复苏。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本
文件。
GB/T 38736-2020 人类生物样本保藏伦理要求
GB/T 39767-2021 人类生物样本管理规范
GB/T 40352.1-2021 人类组织样本采集与处理
国卫科教发〔2023〕4号涉及人的生命科学和医学研究伦理审查办法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
组织活性冻存active cryopreservation of tissue
将临床取得的肿瘤组织，经过适当的处理后进行超低温保存，且活性冻存的肿瘤组织复苏后，能分
离提取具有活性的原代细胞并传代。
3.2
原代细胞primary cell
直接从组织中分离培养的细胞，传代次数不超过10代。
3.3
完全培养基complete medium
通过在基础培养基中添加血清、必要的生长因子等添加剂等物质制备而成。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PBS：磷酸缓冲液
5 组织活性冻存
5.1 组织样本收集与运输
5.1.1 组织样本的收集、处理应遵循《涉及人的生命科学和医学研究伦理审查办法》和GB/T
40352.1-2021 的规定。
5.1.2 组织样本的保藏应遵循GB/T 38736-2020 和GB/T 39767-2021 的规定。
5.1.3 组织样本采集前应通过伦理委员会审批，具备捐赠者或代理人签署的《知情同意书》。
5.1.4 组织样本采集过程中，直接接触样本的所有材料应满足无菌要求。
5.1.5 组织取样的要求，在手术可控范围能获取含肿瘤核心区和边缘区的组织。获取的组织块，应在
清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，推荐剪切至不小于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 组织块放
入保存液内。
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5.1.6 所取组织应尽量在4-6 h 内进行组织预处理，尽快经程序性降温后放入液氮冻存；若不能及时
进行预处理和冻存，应将所取标本于2 ℃-8 ℃临时存放并运输。离体组织的临时保存和运输时间应不
超过24 h。组织预处理及质控需在无菌环境中进行。
5.1.7 组织样本信息采集，在采样管（袋）上标记取样信息，并记录其他必要信息，包括但不限于捐
赠者编号、性别、年龄、疾病名称、取材部位病理诊断等，具体表格可参见附录A，以备后续查询。组
织样本信息管理应在符合《中华人民共和国生物安全法》《国家人类遗传资源管理条例实施细则》等法
律法规的前提下，进行统一管理。
5.2 组织预处理
5.2.1 组织清洗将组织从采样管（袋）中取出置于培养皿中，依次用表面清洗剂1 次、PBS 缓冲液清
洗2 次，每次清洗1 min。
5.2.2 组织剪切将清洗后组织移入新的培养皿中，用眼科剪把组织充分剪碎至颗粒状，最终组织颗粒
大小以小于1 mm 为佳，操作过程中适当滴加少量PBS（0.01mol/L、PH7.2-7.4）保持组织湿润。
5.3 组织冻存
5.3.1 加冻存液
将剪碎的组织转入离心管中，1000 r/min离心5 min，去除上清后按组织体积的4 倍加入组织冻存
液混匀，制备成组织碎片悬液。
5.3.2 冻存管分装
将上述组织碎片悬液分装不少于3 管，每支冻存管加入1 mL组织碎片悬液，并在管身做好标记。标
记规则的设定应能在样本库内有效分辨不同地方来源、肿瘤类型等。
5.3.3 程序降温和液氮保存
将分装好的组织碎片悬液冻存管放入程序降温盒，-80 ℃冰箱中冷冻8-16 h，转移至液氮罐中长
期储存。
6 质量控制与评估
6.1 组织活性冻存质量控制
6.1.1 组织复温
取冻存组织置于37 ℃水浴锅加热3-5 min至完全融化，用复苏液漂洗1 次，1000 r/min离心5 min
收集组织沉淀。
6.1.2 组织消化
用移液管取20 mL消化液37 ℃消化1-3 h，显微镜下观察，当大于50 %的组织块分散为细胞及细胞
团时，终止消化，用70 μm细胞筛过滤收集细胞悬液，1000 r/min离心10 min收集细胞沉淀。
6.1.3 去除红细胞
加入红细胞裂解液，室温下轻柔上下颠倒混合裂解，1000 r/min离心10 min收集细胞沉淀；加入5
mLpH值为7.2-7.4的磷酸缓冲液（PBS），用PBS漂洗2 次，再次离心收集细胞沉淀。
6.1.4 接种培养
将步骤6.1.3所得细胞沉淀，用原代细胞完全培养基重悬后，接种于T25细胞培养瓶中，置于CO2培
养箱进行培养。
6.1.5 原代细胞增殖能力
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将组织复苏提取细胞进行培养，首次满瓶时间不超过2 周的样本可加入原代细胞种子库，满瓶时间
超过2 周的样本建议舍弃并进行无害化处理。纳入原代细胞种子库的细胞样本，应进行支原体、STR等
检测。
6.1.6 原代细胞存活率
细胞存活率可采用台盼蓝拒染法，不适用该方法的样本可采用AO/PI等方法，通过手动计数或自动
细胞计数仪进行检测。手动计数检测细胞存活率宜参考附录B，自动计数仪检测细胞存活率宜依据仪器
检测说明书进行。组织复苏后提取的细胞存活率应不低于60 %。
7 安全与防护
7.1 应具备完善的实验室安全管理制度，同时对工作人员应进行严格的安全培训，培训内容应包括生
物安全二级实验室操作规范、人员操作安全等。
7.2 应建立完整的实验室设备使用和操作规程，保证设备安全运行。
7.3 废弃物的处理
7.3.1 操作流程中产生的废弃物应进行无害化处理。
7.3.2 样本的销毁应进行信息登记，包括但不限于样本编号、销毁原因、批准和执行销毁的日期、销毁
的操作人员等。
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A
A
附录A
（资料性）
样本信息表
供体样本信息表见表A.1（*为必填项）。
表A.1 样本信息表
*捐赠者ID *管身编号
*医院及科室*国际疾病分类ICD-10
*年龄*性别
*取样时间取样数量
*取样器官*取样部位
*现接受的抗癌治疗
□ 1.放疗□ 2.化疗□ 3.靶向治疗□ 4.手术
□ 5.血浆□ 6.无□ 7.其他
*是否有肿瘤手术史□是手术名称日期□否
是否有过往伴随疾病史
□是□否
疾病诊断开始日期是否仍存在结束日期
□ 是□ 否
□ 是□ 否
□ 是□ 否
*样本类型□ 1.手术组织□ 2.穿刺组织□ 3.其他
样本保存液样本临存环境
*样本组织学类型*样本病理分级
运输环境
*样本送达实验室
时间*样本预处理时间
B
B
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附录B
（资料性）
细胞存活率计算方法
B.1 操作步骤
细胞存活率就是活细胞的比例，可用台盼蓝拒染法或AO/PI染色方法计数活细胞。
B.1.1 台盼蓝拒染法
操作步骤如下：
a) 加5 mL 培养基彻底混合细胞悬液。
b) 直接用台盼蓝溶液稀释样本。例如：取20 μL 细胞悬液加入80 μL 台盼蓝溶液中，稀释5 倍。
涡悬振荡，混合稀释的细胞样本。
c) 计数器的准备：首先用酒精清洁其小室和盖玻片，然后用脱脂棉擦干。仔细地将盖玻片覆盖
两个小室。
d) 用微量移液器吸取10 μL 稀释的样本充满两个小室，不要过满或不足。
e) 计数4 个大方格中的细胞总数（1 mm×1 mm×0.1 mm）。死细胞染成蓝色的死细胞（因为细
胞完整性破坏而吸收台盼蓝），活细胞透明有折光（未染色）。
B.1.2 AO/PI染色方法
操作步骤如下：
a) 准备细胞样本：从培养物中收获细胞，使用离心机收集细胞，然后用PBS（磷酸盐缓冲液）重
悬细胞。
b) 配置染色液：准备10x AO/PI 染色液。通常使用吖啶橙和碘化丙啶的混合液，浓度可以根据
具体试剂盒的说明进行调整。
c) 染色过程：将10 μL 细胞悬液与2 μL 染色液混合，轻轻混匀。染色液的终浓度通常为25 μg/mL
PI 和5 μg/mL AO。
d) 孵育时间：将混合物孵育5 分钟，确保染料充分进入细胞。
e) 分析细胞：使用荧光显微镜或自动细胞计数器进行分析。活细胞会发出绿色荧光，而死细胞
会发出红色荧光。
B.2 细胞密度计算方法
每个方格中活细胞总数平均值×稀释倍数×104=活细胞数/mL
B.3 活细胞百分比计算方法
活细胞数÷（活细胞数+死细胞数）×100 %=活细胞百分比
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团体标准
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人源肿瘤组织活性冻存与复苏技术规范
Technical specification for active cryopreservation and resuscitation of human tumortissue
2024 - 12 - 30 发布2024 - 12 - 30 实施
武汉东湖国家自主创新示范区生物医药行业协会 发布
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由武汉大学提出。
本文件由武汉东湖国家自主创新示范区生物医药行业协会归口。
本文件起草单位：武汉大学、中国典型培养物保藏中心、武汉赛尔朗灵科技有限公司、武汉大学细
胞资源库、中国医学科学院基础医学研究所、天津医科大学肿瘤医院肿瘤生物样本库、浙江省肿瘤医院
生物样本库、华中科技大学同济医学院、华中科技大学同济医学院附属同济医院、华中科技大学同济医
学院附属协和医院、武汉儿童医院、武汉大学人民医院、武汉亚洲心脏病医院、湖南省肿瘤医院、中南
大学湘雅医院、中南大学湘雅二医院、中南大学湘雅三医院、中南大学湘雅口腔医学院、复旦大学附属
华山医院、陆军军医大学西南医院、重庆医科大学附属第一医院、贵州医科大学附属医院、南方医科大
学皮肤病医院、湖北省医疗器械质量监督检验研究院、武汉市临床检验中心、武汉市标准化研究院。
本文件主要起草人：沈超、刘玉琴、李继新、王前进、刘霞、吴婕、杨媚媚、何静、夏司璇、王昱
东、熊君、廖聪、李南、周彩虹、李海欣、郑智国、宇兴江、胡志全、杨春光、姜晓兵、章小平、李俊
俊、肖晗、吴业帆、宋启斌、任海波、何正文、申竑、周恩相、黄菊芳、梁青春、王龙、邓智元、何雨
鸣、陈向军、冯华、李飞、贾英、任婕、杨斌、李玲、龚洁、黄勇、任雯菁。
T/WEBIO 0003—2024
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人源肿瘤组织活性冻存与复苏技术规范
1 范围
本文件规定了人源肿瘤组织活性冻存的取样标准、冻存前预处理、深低温保存、复苏培养及质量检
测的操作程序和一般原则。
本文件适用于科研用人源肿瘤组织的活性冻存与复苏。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本
文件。
GB/T 38736-2020 人类生物样本保藏伦理要求
GB/T 39767-2021 人类生物样本管理规范
GB/T 40352.1-2021 人类组织样本采集与处理
国卫科教发〔2023〕4号涉及人的生命科学和医学研究伦理审查办法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
组织活性冻存active cryopreservation of tissue
将临床取得的肿瘤组织，经过适当的处理后进行超低温保存，且活性冻存的肿瘤组织复苏后，能分
离提取具有活性的原代细胞并传代。
3.2
原代细胞primary cell
直接从组织中分离培养的细胞，传代次数不超过10代。
3.3
完全培养基complete medium
通过在基础培养基中添加血清、必要的生长因子等添加剂等物质制备而成。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PBS：磷酸缓冲液
5 组织活性冻存
5.1 组织样本收集与运输
5.1.1 组织样本的收集、处理应遵循《涉及人的生命科学和医学研究伦理审查办法》和GB/T
40352.1-2021 的规定。
5.1.2 组织样本的保藏应遵循GB/T 38736-2020 和GB/T 39767-2021 的规定。
5.1.3 组织样本采集前应通过伦理委员会审批，具备捐赠者或代理人签署的《知情同意书》。
5.1.4 组织样本采集过程中，直接接触样本的所有材料应满足无菌要求。
5.1.5 组织取样的要求，在手术可控范围能获取含肿瘤核心区和边缘区的组织。获取的组织块，应在
清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，推荐剪切至不小于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 组织块放
入保存液内。
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5.1.6 所取组织应尽量在4-6 h 内进行组织预处理，尽快经程序性降温后放入液氮冻存；若不能及时
进行预处理和冻存，应将所取标本于2 ℃-8 ℃临时存放并运输。离体组织的临时保存和运输时间应不
超过24 h。组织预处理及质控需在无菌环境中进行。
5.1.7 组织样本信息采集，在采样管（袋）上标记取样信息，并记录其他必要信息，包括但不限于捐
赠者编号、性别、年龄、疾病名称、取材部位病理诊断等，具体表格可参见附录A，以备后续查询。组
织样本信息管理应在符合《中华人民共和国生物安全法》《国家人类遗传资源管理条例实施细则》等法
律法规的前提下，进行统一管理。
5.2 组织预处理
5.2.1 组织清洗将组织从采样管（袋）中取出置于培养皿中，依次用表面清洗剂1 次、PBS 缓冲液清
洗2 次，每次清洗1 min。
5.2.2 组织剪切将清洗后组织移入新的培养皿中，用眼科剪把组织充分剪碎至颗粒状，最终组织颗粒
大小以小于1 mm 为佳，操作过程中适当滴加少量PBS（0.01mol/L、PH7.2-7.4）保持组织湿润。
5.3 组织冻存
5.3.1 加冻存液
将剪碎的组织转入离心管中，1000 r/min离心5 min，去除上清后按组织体积的4 倍加入组织冻存
液混匀，制备成组织碎片悬液。
5.3.2 冻存管分装
将上述组织碎片悬液分装不少于3 管，每支冻存管加入1 mL组织碎片悬液，并在管身做好标记。标
记规则的设定应能在样本库内有效分辨不同地方来源、肿瘤类型等。
5.3.3 程序降温和液氮保存
将分装好的组织碎片悬液冻存管放入程序降温盒，-80 ℃冰箱中冷冻8-16 h，转移至液氮罐中长
期储存。
6 质量控制与评估
6.1 组织活性冻存质量控制
6.1.1 组织复温
取冻存组织置于37 ℃水浴锅加热3-5 min至完全融化，用复苏液漂洗1 次，1000 r/min离心5 min
收集组织沉淀。
6.1.2 组织消化
用移液管取20 mL消化液37 ℃消化1-3 h，显微镜下观察，当大于50 %的组织块分散为细胞及细胞
团时，终止消化，用70 μm细胞筛过滤收集细胞悬液，1000 r/min离心10 min收集细胞沉淀。
6.1.3 去除红细胞
加入红细胞裂解液，室温下轻柔上下颠倒混合裂解，1000 r/min离心10 min收集细胞沉淀；加入5
mLpH值为7.2-7.4的磷酸缓冲液（PBS），用PBS漂洗2 次，再次离心收集细胞沉淀。
6.1.4 接种培养
将步骤6.1.3所得细胞沉淀，用原代细胞完全培养基重悬后，接种于T25细胞培养瓶中，置于CO2培
养箱进行培养。
6.1.5 原代细胞增殖能力
T/WEBIO 0003—2024
3
将组织复苏提取细胞进行培养，首次满瓶时间不超过2 周的样本可加入原代细胞种子库，满瓶时间
超过2 周的样本建议舍弃并进行无害化处理。纳入原代细胞种子库的细胞样本，应进行支原体、STR等
检测。
6.1.6 原代细胞存活率
细胞存活率可采用台盼蓝拒染法，不适用该方法的样本可采用AO/PI等方法，通过手动计数或自动
细胞计数仪进行检测。手动计数检测细胞存活率宜参考附录B，自动计数仪检测细胞存活率宜依据仪器
检测说明书进行。组织复苏后提取的细胞存活率应不低于60 %。
7 安全与防护
7.1 应具备完善的实验室安全管理制度，同时对工作人员应进行严格的安全培训，培训内容应包括生
物安全二级实验室操作规范、人员操作安全等。
7.2 应建立完整的实验室设备使用和操作规程，保证设备安全运行。
7.3 废弃物的处理
7.3.1 操作流程中产生的废弃物应进行无害化处理。
7.3.2 样本的销毁应进行信息登记，包括但不限于样本编号、销毁原因、批准和执行销毁的日期、销毁
的操作人员等。
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A
A
附录A
（资料性）
样本信息表
供体样本信息表见表A.1（*为必填项）。
表A.1 样本信息表
*捐赠者ID *管身编号
*医院及科室*国际疾病分类ICD-10
*年龄*性别
*取样时间取样数量
*取样器官*取样部位
*现接受的抗癌治疗
□ 1.放疗□ 2.化疗□ 3.靶向治疗□ 4.手术
□ 5.血浆□ 6.无□ 7.其他
*是否有肿瘤手术史□是手术名称日期□否
是否有过往伴随疾病史
□是□否
疾病诊断开始日期是否仍存在结束日期
□ 是□ 否
□ 是□ 否
□ 是□ 否
*样本类型□ 1.手术组织□ 2.穿刺组织□ 3.其他
样本保存液样本临存环境
*样本组织学类型*样本病理分级
运输环境
*样本送达实验室
时间*样本预处理时间
B
B
T/WEBIO 0003—2024
5
附录B
（资料性）
细胞存活率计算方法
B.1 操作步骤
细胞存活率就是活细胞的比例，可用台盼蓝拒染法或AO/PI染色方法计数活细胞。
B.1.1 台盼蓝拒染法
操作步骤如下：
a) 加5 mL 培养基彻底混合细胞悬液。
b) 直接用台盼蓝溶液稀释样本。例如：取20 μL 细胞悬液加入80 μL 台盼蓝溶液中，稀释5 倍。
涡悬振荡，混合稀释的细胞样本。
c) 计数器的准备：首先用酒精清洁其小室和盖玻片，然后用脱脂棉擦干。仔细地将盖玻片覆盖
两个小室。
d) 用微量移液器吸取10 μL 稀释的样本充满两个小室，不要过满或不足。
e) 计数4 个大方格中的细胞总数（1 mm×1 mm×0.1 mm）。死细胞染成蓝色的死细胞（因为细
胞完整性破坏而吸收台盼蓝），活细胞透明有折光（未染色）。
B.1.2 AO/PI染色方法
操作步骤如下：
a) 准备细胞样本：从培养物中收获细胞，使用离心机收集细胞，然后用PBS（磷酸盐缓冲液）重
悬细胞。
b) 配置染色液：准备10x AO/PI 染色液。通常使用吖啶橙和碘化丙啶的混合液，浓度可以根据
具体试剂盒的说明进行调整。
c) 染色过程：将10 μL 细胞悬液与2 μL 染色液混合，轻轻混匀。染色液的终浓度通常为25 μg/mL
PI 和5 μg/mL AO。
d) 孵育时间：将混合物孵育5 分钟，确保染料充分进入细胞。
e) 分析细胞：使用荧光显微镜或自动细胞计数器进行分析。活细胞会发出绿色荧光，而死细胞
会发出红色荧光。
B.2 细胞密度计算方法
每个方格中活细胞总数平均值×稀释倍数×104=活细胞数/mL
B.3 活细胞百分比计算方法
活细胞数÷（活细胞数+死细胞数）×100 %=活细胞百分比