T/CHATA 039-2024 分枝杆菌新菌种鉴定及命名规范
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资料介绍
ICS 11.020
CCS C 05
团体标准
T/CHATA 039—2024分枝杆菌新菌种鉴定及命名规范
Identification and nomenclature criterion of a novel mycobacteriumspecies
2024-08-19发布2024-08-19实施
中国防痨协会发布
目次
前言.....................................................................................................................................................................IIIII
1 范围....................................................................................................................................................................1
2 规范性引用文件................................................................................................................................................1
3 术语和定义........................................................................................................................................................1
4 分枝杆菌新菌种鉴定流程错误！未定义书签4.1 提示可能为分枝杆菌新菌种的线索..................................................................错误！未定义书签。
4.2 分枝杆菌最低鉴定标准.......................................................................................错误！未定义书签。
4.2.1 抗酸性...................................................................................................... 错误！未定义书签。
4.2.2 分枝菌酸分析..........................................................................................错误！未定义书签。
4.2.3 基因组碱基组成中G+C 含量检测..........................................................错误！未定义书签。
4.3 分枝杆菌鉴定表型特征分析..............................................................................错误！未定义书签。
4.3.1 形态学...................................................................................................... 错误！未定义书签。
4.3.2 生化和培养试验......................................................................................错误！未定义书签。
4.3.3 药物敏感性试验......................................................................................错误！未定义书签。
4.3.4 分枝菌酸特征..........................................................................................错误！未定义书签。
4.3.5 肽段组成特征..........................................................................................错误！未定义书签。
4.4 基因型特征分析..................................................................................................错误！未定义书签。
4.4.1 16S rDNA 和其他同源基因/序列分析...................................................错误！未定义书签。
4.4.2 全基因组水平的DNA-DNA 杂交和ΔTm 值........................................... 错误！未定义书签。
4.4.3 使用全基因组数据进行原核生物分类标准.......................................... 错误！未定义书签。
4.5 新菌种的提出....................................................................................................... 错误！未定义书签。
5 分枝杆菌新菌种的保藏..................................................................................................错误！未定义书签。
6 分枝杆菌新菌种命名...................................................................................................... 错误！未定义书签。
6.1 新菌种命名方法..................................................................................................错误！未定义书签。
6.2 新菌种命名权的认定..........................................................................................错误！未定义书签。
附录A（规范性）用于新菌种鉴定的分枝杆菌培养和生化试验方法.................. 错误！未定义书签。
附录B（资料性）16S rDNA、hsp65、rpoB、sodA 基因扩增引物序列............... 错误！未定义书签。
附录C（资料性）使用全基因组数据进行原核生物分类标准.............................. 错误！未定义书签。
附录D（资料性）新菌种鉴定流程图.......................................................................错误！未定义书签。
附录E（资料性）具有国际影响力的菌种保藏中心及其缩略名称...................... 错误！未定义书签。
参考文献...................................................................................................................... 错误！未定义书签。
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III
前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规
定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由首都医科大学附属北京胸科医院、中国疾病预防控制中心共同提出。
本文件由中国防痨协会归口。
本文件起草单位：首都医科大学附属北京胸科医院、中国疾病预防控制中心、武汉市肺科医院、首
都医科大学附属北京儿童医院、解放军总医院第八医学中心、中国疾病预防控制中心传染病控制所、上
海市疾病预防控制中心、上海市肺科医院、天津市海河医院、湖南省胸科医院、广州市胸科医院、福建
省福州结核病防治院、河南省胸科医院、河北省胸科医院、遵义医科大学附属医院。
本文件主要起草人：黄海荣、赵雁林、于霞、陈素婷、张宗德、李卫民、夏辉、刘冠、申阿东、
吴雪琼、万康林、沈鑫、余方友、张丽霞、谭云洪、刘志辉、黄明翔、王伟、梁瑞霞、杜建、姜广路、
霍凤敏、郑立恒、宗兆婧、王桂荣、孙照刚、车南颖、刘毅。
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分枝杆菌新菌种鉴定及命名规范
1 范围
本文件规定了分枝杆菌新菌种鉴定、保藏及命名的流程。
本文件适用于医疗卫生机构、疾病预防控制机构和科研院所对环境来源和宿主中分离的分枝杆菌新
菌种的鉴定及命名。
2 规范性引用文件
本文件没有规范性引用文件。
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
细菌鉴定identification of bacteria
将未知细菌按分类原则，确定细菌的分类地位。
3.2
细菌命名nomenclature of bacteria
在分类基础上，给每种细菌一个科学名称，以便使用者对同一个菌种的细菌应用同一名称，利于交
流。
3.3
标准菌株type strain
由国内或国际菌种保藏机构保藏的遗传学特性得到确认和保证并可追溯来源的菌株。
注：标准菌株也称模式菌株，以活菌状态保存,被指定为细菌“种”的代表，是用于分类研究“种”的参考模型。
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2
3.4
种species
细菌学分类的最基本单元，生物学性状基本相同的细菌群体归为一个菌种。
3.5
亚种subspecies
同一菌种的不同菌株间在某个或某些生物学性状上存在一定差异的群体。
4 分枝杆菌新菌种鉴定流程
4.1 提示可能为分枝杆菌新菌种的线索
目标分枝杆菌出现疑似分枝杆菌新菌种的表型特征和/或同源基因/序列特征：
a）目标分枝杆菌展现出与已知分枝杆菌菌种明显不同的某种表型特点；
b）目标分枝杆菌与所有已知分枝杆菌菌种的同源基因/序列比对满足以下条件时，提示可能是分
枝杆菌新菌种： 16S rDNA 的异质性大于1%和/或与常用于分枝杆菌菌种鉴定的rpoB、hsp65 和16-23S
rRNA 转录间隔区序列（internal transcribed spacer，ITS）等分子标识的异质性大于3%。
分枝杆菌新菌种的最终定义依赖于以下完整鉴定程序的确认。
4.2 分枝杆菌最低鉴定标准
4.2.1 抗酸性
分枝杆菌细胞壁富含分枝菌酸，分枝菌酸在被染料（复红或金胺“O”）染色后能抵抗盐酸乙醇等
脱色剂的脱色处理，即具有抗酸性。上述特性可被显微镜观察确认，常用染色方法包括萋-尼氏染色和
荧光染色。
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4.2.2 分枝菌酸分析
分枝杆菌细胞壁中的长链分枝菌酸通过裂解可产生直链酯，碳链长度在C22 到C26 之间，不同分枝
杆菌菌种细胞壁裂解后的直链酯组成具有种特征性的图谱。常用的直链酯检测方法包括气相色谱法和高
效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）。
4.2.3 基因组碱基组成中G+C 含量检测
分枝杆菌基因组G+C 碱基含量为61%～71%。常用检测方法包括熔解温度法和HPLC，但近年多用全
基因组测序技术检测基因组碱基组成的G+C 含量。
4.3 分枝杆菌鉴定表型特征分析
4.3.1 形态学
观察分枝杆菌在显微镜下的形态以及在固体培养基上菌落生长形态。包括细菌形态(如光滑或粗糙、
菌落颜色等)和结构、菌体或菌毛的长度和宽度等。有些分枝杆菌的生长形态并不固定，这种情况下所
有形态都应描述。
4.3.2 生化和培养试验
分枝杆菌属的菌种鉴定包括一系列生化试验和培养试验，试验方法按附录A 的规定。需要注意的是，
开展生化试验时要求分枝杆菌处于良好的生长状态，否则可能会影响检测结果，但过期生长的细菌可用
于观察分枝杆菌产色情况、光反应和开展烟酸试验。
4.3.3 药物敏感性试验
分枝杆菌多具有致病性或条件致病性，因此新菌种鉴定应常规开展细菌对常用抗结核药物和其他常
见抗菌药物的药物敏感性检测。一般采样检测药物最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,
MIC）的方法判定药物敏感性。
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4.3.4 分枝菌酸特征
不同种分枝杆菌细胞壁裂解后形成种特征性的分枝菌酸指纹图谱，通过HPLC 可检测分枝菌酸组成
情况，与分枝菌酸标准数据库进行比对。新的分枝杆菌菌种的分枝菌酸指纹图谱常与数据库中的已知菌
种图谱呈现明显差异。
4.3.5 肽段组成特征
利用不同分枝杆菌肽段组成的不同，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted
laser desorption ionization time-of-flight MS, MALDI-TOF-MS）分析细菌肽段在真空电离过程中
由于质荷比不同所获得的特征性肽段谱，与已有肽段图谱标准数据库进行比对，将分枝杆菌鉴定至种水
平。新的分枝杆菌菌种的肽段图谱常与数据库中的已知菌种肽段图谱呈现明显差异。
4.4 基因型特征分析
4.4.1 16S rDNA 和其他同源基因/序列分析
新的分枝杆菌菌种鉴定时同源基因/序列的比对分析应包括全长的16S rDNA 序列比对，同时还要包
括但不限于下列同源基因/序列的比对：hsp65、rpoB、ITS 序列及sodA 等全长或部分序列高可变区。
除了同源基因/序列的相似度直接比较外，还要绘制单个基因/序列和串联序列的进化树，以分析分枝杆
菌的进化位置。扩增以上基因常见引物序列见附录B。
4.4.2 全基因组水平的DNA-DNA 杂交和ΔTm 值
细菌种类的定义依据还包括全基因组水平的DNA-DNA 杂交试验结果及复性温度变化值（ΔTm 值）。
根据细菌分类方法协调特别委员会标准：新菌种的定义是待测菌株与已知菌种在基因组水平的DNA 相似
度小于70%，且ΔTm 值大于6℃。DNA-DNA 杂交试验可在滤膜或溶液中进行，但是复性温度受很多因素
影响，分析同源性时应谨慎开展试验，以保证结果的可靠性。
4.4.3 使用全基因组数据进行原核生物分类标准
全基因组测序已逐步取代全基因组水平的DNA-DNA 杂交分析，成为分枝杆菌菌种分类的金标准，见
附录C。目前，公认的新菌种鉴定的指标主要包括平均核苷酸同一性(average nucleotide identity, ANI)
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和数字化DNA-DNA 杂交预测值（digital DNA–DNA hybridization，dDDH）。在获得符合原核生物鉴定
的全基因组序列后， ANI 可通过网站(http://enve-omics.ce.gatech.edu/ani/) 计算； dDDH 采用
Genome-to-Genome Distance Calculator 2.1 (http://ggdc.dsmz.de/ggdc.php）和formula 2 计算。
公认的ANI 临界值为95%～96%。
4.5 新菌种的提出
当目标分枝杆菌出现疑似新菌种的表型和/或基因/序列特征时，且与已知进化关系最近标准菌株相
比：ANI＜95%时，目标分枝杆菌可定义为新菌种；ANI 在95%～96%且dDDH＜70%,目标分枝杆菌可定义
为新菌种（见附录D）。
5 分枝杆菌新菌种的保藏
在发布一个分枝杆菌新菌种前，依据国际通用规则，应将该菌种的标准菌株至少保存到2 个不同国
家和地区的国际性菌种保藏中心，并获得由菌种保藏中心提供的英文的馆藏证明。国内主要菌种保藏机
构（见附录E）有中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)和中国
医学细菌保藏管理中心(CMCC)，能提供国际性的专利菌种保藏，但涉及与人类疾病相关的医学菌种应在
CMCC 保藏。
6 分枝杆菌新菌种命名
6.1 新菌种命名方法
分枝杆菌新菌种的命名遵从《国际原核生物命名守则》(International Code of Nomenclature of
Prokaryotes)最新版本，当前为2019 修订版。文件规定所有的细菌菌种命名采用“双名”法则，第一
个词代表“属”，第二个词为修饰词，多为人名、地名或菌种特性描述性词语。亚种命名采用“三名”
法则。中文译名参考《分枝杆菌菌种中文译名原则专家共识》。
6.2 新菌种命名权的认定
按国际系统原核生物学委员会的规定，任何鉴定和命名的细菌的新分类单元，其相关论文都应发表
在《国际系统与进化微生物学杂志》(International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology)，如在其他杂志发表，应提交论文副本给该杂志公布。
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附录A
（规范性）
用于新菌种鉴定的分枝杆菌培养和生化试验方法见表A.1。
表A.1 用于新菌种鉴定的分枝杆菌培养和生化试验方法
序号试验名称是否必须具体方法参见以下文件
1 产色、光反应是
1. V V Lévy-Frébault, F Portaels. Proposed minimal
standards for the genus Mycobacterium and for
description of new slowly growing Mycobacterium
species. Int J Syst Bacteriol.
1992;42(2):315-323.
2. 中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验
规程.北京：中国教育文化出版社,2006.
3. 赵雁林，逄宇.结核病诊断实验室检验规程.北京：人民
卫生出版社,2015.
2 不同温度生长试验是
3 耐异烟肼试验是
4 耐噻吩-2-羧酸肼试验是
5 耐羟胺试验是
6 耐对硝基苯甲酸试验是
7 耐氯化钠试验是
8 耐胺硫脲试验是
9 耐苦味酸试验是
10 耐油酸试验是
11 过氧化氢酶试验是
12 吐温-80 水解试验是
13 尿素酶试验是
14 烟酸试验是
15 硝酸还原试验是
16 酸性磷酸酶试验是
17 芳基硫酸酯酶试验是
18 吡嗪酰胺酶试验是
19 α-酯酶活性试验是
20 生长速度是
21 铁离子吸收试验否
22 亚碲酸盐还原试验否
23 麦康凯琼脂培养基生长
试验
否
24 谷氨酸钠葡萄糖琼脂培
养基生长试验
否
25 其他否其他
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附录B
（资料性）
用于16S rDNA、hsp65、rpoB、sodA 等基因扩增的常用引物序列
用于16S rDNA、hsp65、rpoB、sodA 等基因扩增的常用引物序列见表B.1。
表B.1 用于16S rDNA、hsp65、rpoB、sodA 等基因扩增的常用引物序列
序列名称上游序列下游序列
全长16S rDNA 27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’） 1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）
部分hsp65 HSPF3 (5’-ATCGCCAAGGAGATCGAGCT-3’） HSPR4 (5’-AAGGTGCCGCGGATCTTGTT-3’）
rpoB Ⅲ高可变区MF（5’-CGACCACTTCGGCAACCG -3’） MR（5’-TCGATCGGGCACATCCGG -3’）
ITS ITS1-1511F（5’-AAGTCGTAACAAGGTARCCG-3’） ITS1-23R（5’-TCGCCAAGGCATCCACC-3’）
sodA Sod A-F（5’- GGCCAGGTTCTTCTCGTTCA -3’） SodA-R（5’-CGCCGCATATGTCAAAGGTG -3’）
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附录C
（资料性）
使用全基因组数据进行原核生物分类标准
C.1 以分类为目的的基因组序列数据的最低标准
C.1.1 DNA 测序平台
尽管不同的微生物学分类标准对最终组装的重叠群的准确性和质量有不同的要求，但以分类为目的
而产生的基因组序列也应用于其他领域，如环境和临床微生物学。目前，MGISEQ、Illumina、Ion Torrent
和Pacific Biosciences 等提供的DNA 测序平台通常生成符合一般标准的DNA 序列数据。任何其他未来
可用的新一代测序(next generation sequencing, NGS)平台在用于原核生物分类学研究之前,都应经过
严格的评估。
C.1.2 原始NGS 数据和组装基因组序列的质量
C.1.2.1 基因组大小
基因组大小定义为所有重叠群（contigs）的长度总和。如果基因组序列未完全确定，则该值仅代
表近似值。
C.1.2.2 片段重叠群的数量和N50
基因组组装过程产生不同长度的重叠群。通常情况下，首先需要从最终装配中排除非常短的重叠部
分。在选择片段重叠群方面没有明确的标准，单重叠群的数量不能很好地反映基因组序列的质量。可使
用已知的N50 对最终组装进行更准确的评估。N50 定义为将重叠群的长度从最长到最短相加，累计50%
的最短重叠群长度。
C.1.2.3 测序覆盖深度
该值通常用倍数（fold）来反映。这个统计数据可在所有DNA 测序平台上用适当的基因组组装软件
进行测量。对于具有不同精度和读取长度的NGS 平台，很难推荐单个值作为标准。理论上，生成的fold
读取越多，组装的质量越好。宜将目前NGS 平台（illumina、Ion Torrent 和Pacific Biosciences）
的测序深度设置为50 倍及以上。
C.1.3 基因组组装的真实性
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在基因组测序过程中，菌株及其基因组数据常常被错误地标记，导致出现错误的分类。这在一定程
度上是因为基因组测序过程中的错误标记和污染的可能性相对较高。因此，需要核对获得的基因组序列
是否确实属于被测菌株。
因为几乎所有已知物种类型菌株的16S rDNA 序列都是可用的，所以该基因可用于确认最终基因组
组装序列的真实性。对于系统发育学相近的16S rDNA 序列非常相似的物种，gyrB、rpoB 和recA 等蛋
白质编码基因，可用于进一步支持基因组数据的真实性。为了实现这一点，应从基因组组装序列中提取
全长16S rDNA 或蛋白质编码基因。如果多个rRNA 操纵子中的16S rDNA 序列之间存在实质性差异，则
应通过分子克隆和测序来解决这一问题。为了描述新菌种，应通过常规Sanger 测序获得系统发育学相
近菌种标准菌株的全长16S rDNA 序列，并与从被测菌株全基因组组装序列中提取的16S rDNA 序列进行
比较，以确保基因组数据的真实性。如果不能从基因组组装序列中提取全长16S rDNA 序列，可使用其
他蛋白质编码基因代替16S rDNA 序列。但无论在哪种情况下，应获得来自系统发育学相近菌种的标准
菌株全长16S rDNA 序列。
C.1.4 基因组组装中的污染
NGS 可生成高通量数据，其测序覆盖深度比传统的Sanger 测序更高，但缺点是容易产生DNA 污染。
即使是少量DNA 污染，也可能被纳入基因组组装中。由于在分枝杆菌领域中横向基因转移事件的发生频
率不高，可使用蛋白质编码基因检查污染情况。
C.2 测序数据的保存
由于基因组序列组装过程可能很难复制，宜避免仅保存原始NGS 数据（没有最终组装）。组装后的
基因组数据应存入GenBank/EMBL/DDBJ 数据库，或其他已被认可的公用数据库。
C.3 从公共领域选择参考基因组数据
目前，很多菌种可获得多个基因组序列。因此，选择质量最好的真实基因组序列进行OGRI 和系统
发育树分析非常重要。选择具有最佳质量的基因组序列的标准是依据N50 值，N50 值越大，基因组数据
质量越高。此外，分类学研究中的参考基因组应是被检测菌种的标准菌株。
C.4 分类目的的生物信息学
C.4.1 基因组数据识别新菌种
DDH 被定义为原核生物的物种边界，至今仍作为原核生物分类学的金标准。ANI 广泛应用于计算系
统发育进化上相近菌种间的分类。ANI 的替代指标是dDDH ， 可通过网站进行计算
（https://ggdc.dsmz.de/ggdc.php），也被广泛用于分类鉴定。
C.4.2 基因组数据识别亚种
目前，尚无使用基因组数据定义亚种的指南，一般认为包括以下标准：
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a）亚种和其他菌种之间的ANI 应低于菌种水平的临界值；
b）亚种之间的ANI 应高于菌种水平的临界值；
c）属于不同亚种的菌株应在基因组上一致，并通过ANI 和系统发育树形成可区分的分支；
d）亚种应通过足够数量的表型进行区分；
e）命名亚种应有一个合理的理由来解释。
C.4.3 系统进化树
鉴于基因组序列中存在的大量信息，能够在不同的分类水平上探索更精确的系统发育关系。将基因
组数据应用于系统发育分析，称为系统发育树，可通过基于多个基因而不是单个基因（如16S rDNA）
推断系统发育树来实现。系统基因组学应提供更好的分类框架，特别是在属和更高层次上。针对分枝杆
菌常用的系统进化分析的基因常包括16S rDNA、rpoB、hsp65 及rpsA。
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附录D
（资料性）
新菌种鉴定流程图
新菌种鉴定流程图见图B.1。
图B.1 新菌种鉴定流程图
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12
附录E
（资料性）
具有国际影响力的菌种保藏中心及其缩略名称
具有国际影响力的菌种保藏中心及其缩略名称见表E.1。
E.1 具有国际影响力的菌种保藏中心及其缩略名称
菌种保藏中心缩略名词
美国典型菌种保藏中心ATCC
中国典型培养物保藏中心CCTCC
瑞典哥德堡大学菌种保藏中心CCUG
美国疾病预防与控制中心CDC
西班牙典型菌种保藏中心CECT
中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC
法国巴斯德研究所菌种保藏中心CIP
中国医学细菌保藏管理中心CMCC
法国立克次体株保藏中心CSUR
德国微生物菌种保藏中心DSM
芬兰赫尔辛基大学农业和林业系应用化学和微生物
部门菌种保藏中心
HAMBI
法国国家卫生保健质量控制中心INCQS
日本微生物保藏中心JCM
韩国典型菌种保藏中心KCTC
英国国家典型菌种保藏中心NCTC
比利时根特大学微生物学实验室LMG
日本技术评价研究所生物资源中心NBRC
荷兰细菌保藏中心NCCB
英国国家工业、食品、海洋细菌保藏中心NCIMB
全俄微生物保藏中心VKM
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参考文献
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团体标准
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中国防痨协会发布
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前言.....................................................................................................................................................................IIIII
1 范围....................................................................................................................................................................1
2 规范性引用文件................................................................................................................................................1
3 术语和定义........................................................................................................................................................1
4 分枝杆菌新菌种鉴定流程错误！未定义书签4.1 提示可能为分枝杆菌新菌种的线索..................................................................错误！未定义书签。
4.2 分枝杆菌最低鉴定标准.......................................................................................错误！未定义书签。
4.2.1 抗酸性...................................................................................................... 错误！未定义书签。
4.2.2 分枝菌酸分析..........................................................................................错误！未定义书签。
4.2.3 基因组碱基组成中G+C 含量检测..........................................................错误！未定义书签。
4.3 分枝杆菌鉴定表型特征分析..............................................................................错误！未定义书签。
4.3.1 形态学...................................................................................................... 错误！未定义书签。
4.3.2 生化和培养试验......................................................................................错误！未定义书签。
4.3.3 药物敏感性试验......................................................................................错误！未定义书签。
4.3.4 分枝菌酸特征..........................................................................................错误！未定义书签。
4.3.5 肽段组成特征..........................................................................................错误！未定义书签。
4.4 基因型特征分析..................................................................................................错误！未定义书签。
4.4.1 16S rDNA 和其他同源基因/序列分析...................................................错误！未定义书签。
4.4.2 全基因组水平的DNA-DNA 杂交和ΔTm 值........................................... 错误！未定义书签。
4.4.3 使用全基因组数据进行原核生物分类标准.......................................... 错误！未定义书签。
4.5 新菌种的提出....................................................................................................... 错误！未定义书签。
5 分枝杆菌新菌种的保藏..................................................................................................错误！未定义书签。
6 分枝杆菌新菌种命名...................................................................................................... 错误！未定义书签。
6.1 新菌种命名方法..................................................................................................错误！未定义书签。
6.2 新菌种命名权的认定..........................................................................................错误！未定义书签。
附录A（规范性）用于新菌种鉴定的分枝杆菌培养和生化试验方法.................. 错误！未定义书签。
附录B（资料性）16S rDNA、hsp65、rpoB、sodA 基因扩增引物序列............... 错误！未定义书签。
附录C（资料性）使用全基因组数据进行原核生物分类标准.............................. 错误！未定义书签。
附录D（资料性）新菌种鉴定流程图.......................................................................错误！未定义书签。
附录E（资料性）具有国际影响力的菌种保藏中心及其缩略名称...................... 错误！未定义书签。
参考文献...................................................................................................................... 错误！未定义书签。
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III
前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规
定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由首都医科大学附属北京胸科医院、中国疾病预防控制中心共同提出。
本文件由中国防痨协会归口。
本文件起草单位：首都医科大学附属北京胸科医院、中国疾病预防控制中心、武汉市肺科医院、首
都医科大学附属北京儿童医院、解放军总医院第八医学中心、中国疾病预防控制中心传染病控制所、上
海市疾病预防控制中心、上海市肺科医院、天津市海河医院、湖南省胸科医院、广州市胸科医院、福建
省福州结核病防治院、河南省胸科医院、河北省胸科医院、遵义医科大学附属医院。
本文件主要起草人：黄海荣、赵雁林、于霞、陈素婷、张宗德、李卫民、夏辉、刘冠、申阿东、
吴雪琼、万康林、沈鑫、余方友、张丽霞、谭云洪、刘志辉、黄明翔、王伟、梁瑞霞、杜建、姜广路、
霍凤敏、郑立恒、宗兆婧、王桂荣、孙照刚、车南颖、刘毅。
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1
分枝杆菌新菌种鉴定及命名规范
1 范围
本文件规定了分枝杆菌新菌种鉴定、保藏及命名的流程。
本文件适用于医疗卫生机构、疾病预防控制机构和科研院所对环境来源和宿主中分离的分枝杆菌新
菌种的鉴定及命名。
2 规范性引用文件
本文件没有规范性引用文件。
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
细菌鉴定identification of bacteria
将未知细菌按分类原则，确定细菌的分类地位。
3.2
细菌命名nomenclature of bacteria
在分类基础上，给每种细菌一个科学名称，以便使用者对同一个菌种的细菌应用同一名称，利于交
流。
3.3
标准菌株type strain
由国内或国际菌种保藏机构保藏的遗传学特性得到确认和保证并可追溯来源的菌株。
注：标准菌株也称模式菌株，以活菌状态保存,被指定为细菌“种”的代表，是用于分类研究“种”的参考模型。
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2
3.4
种species
细菌学分类的最基本单元，生物学性状基本相同的细菌群体归为一个菌种。
3.5
亚种subspecies
同一菌种的不同菌株间在某个或某些生物学性状上存在一定差异的群体。
4 分枝杆菌新菌种鉴定流程
4.1 提示可能为分枝杆菌新菌种的线索
目标分枝杆菌出现疑似分枝杆菌新菌种的表型特征和/或同源基因/序列特征：
a）目标分枝杆菌展现出与已知分枝杆菌菌种明显不同的某种表型特点；
b）目标分枝杆菌与所有已知分枝杆菌菌种的同源基因/序列比对满足以下条件时，提示可能是分
枝杆菌新菌种： 16S rDNA 的异质性大于1%和/或与常用于分枝杆菌菌种鉴定的rpoB、hsp65 和16-23S
rRNA 转录间隔区序列（internal transcribed spacer，ITS）等分子标识的异质性大于3%。
分枝杆菌新菌种的最终定义依赖于以下完整鉴定程序的确认。
4.2 分枝杆菌最低鉴定标准
4.2.1 抗酸性
分枝杆菌细胞壁富含分枝菌酸，分枝菌酸在被染料（复红或金胺“O”）染色后能抵抗盐酸乙醇等
脱色剂的脱色处理，即具有抗酸性。上述特性可被显微镜观察确认，常用染色方法包括萋-尼氏染色和
荧光染色。
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3
4.2.2 分枝菌酸分析
分枝杆菌细胞壁中的长链分枝菌酸通过裂解可产生直链酯，碳链长度在C22 到C26 之间，不同分枝
杆菌菌种细胞壁裂解后的直链酯组成具有种特征性的图谱。常用的直链酯检测方法包括气相色谱法和高
效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）。
4.2.3 基因组碱基组成中G+C 含量检测
分枝杆菌基因组G+C 碱基含量为61%～71%。常用检测方法包括熔解温度法和HPLC，但近年多用全
基因组测序技术检测基因组碱基组成的G+C 含量。
4.3 分枝杆菌鉴定表型特征分析
4.3.1 形态学
观察分枝杆菌在显微镜下的形态以及在固体培养基上菌落生长形态。包括细菌形态(如光滑或粗糙、
菌落颜色等)和结构、菌体或菌毛的长度和宽度等。有些分枝杆菌的生长形态并不固定，这种情况下所
有形态都应描述。
4.3.2 生化和培养试验
分枝杆菌属的菌种鉴定包括一系列生化试验和培养试验，试验方法按附录A 的规定。需要注意的是，
开展生化试验时要求分枝杆菌处于良好的生长状态，否则可能会影响检测结果，但过期生长的细菌可用
于观察分枝杆菌产色情况、光反应和开展烟酸试验。
4.3.3 药物敏感性试验
分枝杆菌多具有致病性或条件致病性，因此新菌种鉴定应常规开展细菌对常用抗结核药物和其他常
见抗菌药物的药物敏感性检测。一般采样检测药物最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,
MIC）的方法判定药物敏感性。
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4
4.3.4 分枝菌酸特征
不同种分枝杆菌细胞壁裂解后形成种特征性的分枝菌酸指纹图谱，通过HPLC 可检测分枝菌酸组成
情况，与分枝菌酸标准数据库进行比对。新的分枝杆菌菌种的分枝菌酸指纹图谱常与数据库中的已知菌
种图谱呈现明显差异。
4.3.5 肽段组成特征
利用不同分枝杆菌肽段组成的不同，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted
laser desorption ionization time-of-flight MS, MALDI-TOF-MS）分析细菌肽段在真空电离过程中
由于质荷比不同所获得的特征性肽段谱，与已有肽段图谱标准数据库进行比对，将分枝杆菌鉴定至种水
平。新的分枝杆菌菌种的肽段图谱常与数据库中的已知菌种肽段图谱呈现明显差异。
4.4 基因型特征分析
4.4.1 16S rDNA 和其他同源基因/序列分析
新的分枝杆菌菌种鉴定时同源基因/序列的比对分析应包括全长的16S rDNA 序列比对，同时还要包
括但不限于下列同源基因/序列的比对：hsp65、rpoB、ITS 序列及sodA 等全长或部分序列高可变区。
除了同源基因/序列的相似度直接比较外，还要绘制单个基因/序列和串联序列的进化树，以分析分枝杆
菌的进化位置。扩增以上基因常见引物序列见附录B。
4.4.2 全基因组水平的DNA-DNA 杂交和ΔTm 值
细菌种类的定义依据还包括全基因组水平的DNA-DNA 杂交试验结果及复性温度变化值（ΔTm 值）。
根据细菌分类方法协调特别委员会标准：新菌种的定义是待测菌株与已知菌种在基因组水平的DNA 相似
度小于70%，且ΔTm 值大于6℃。DNA-DNA 杂交试验可在滤膜或溶液中进行，但是复性温度受很多因素
影响，分析同源性时应谨慎开展试验，以保证结果的可靠性。
4.4.3 使用全基因组数据进行原核生物分类标准
全基因组测序已逐步取代全基因组水平的DNA-DNA 杂交分析，成为分枝杆菌菌种分类的金标准，见
附录C。目前，公认的新菌种鉴定的指标主要包括平均核苷酸同一性(average nucleotide identity, ANI)
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5
和数字化DNA-DNA 杂交预测值（digital DNA–DNA hybridization，dDDH）。在获得符合原核生物鉴定
的全基因组序列后， ANI 可通过网站(http://enve-omics.ce.gatech.edu/ani/) 计算； dDDH 采用
Genome-to-Genome Distance Calculator 2.1 (http://ggdc.dsmz.de/ggdc.php）和formula 2 计算。
公认的ANI 临界值为95%～96%。
4.5 新菌种的提出
当目标分枝杆菌出现疑似新菌种的表型和/或基因/序列特征时，且与已知进化关系最近标准菌株相
比：ANI＜95%时，目标分枝杆菌可定义为新菌种；ANI 在95%～96%且dDDH＜70%,目标分枝杆菌可定义
为新菌种（见附录D）。
5 分枝杆菌新菌种的保藏
在发布一个分枝杆菌新菌种前，依据国际通用规则，应将该菌种的标准菌株至少保存到2 个不同国
家和地区的国际性菌种保藏中心，并获得由菌种保藏中心提供的英文的馆藏证明。国内主要菌种保藏机
构（见附录E）有中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)和中国
医学细菌保藏管理中心(CMCC)，能提供国际性的专利菌种保藏，但涉及与人类疾病相关的医学菌种应在
CMCC 保藏。
6 分枝杆菌新菌种命名
6.1 新菌种命名方法
分枝杆菌新菌种的命名遵从《国际原核生物命名守则》(International Code of Nomenclature of
Prokaryotes)最新版本，当前为2019 修订版。文件规定所有的细菌菌种命名采用“双名”法则，第一
个词代表“属”，第二个词为修饰词，多为人名、地名或菌种特性描述性词语。亚种命名采用“三名”
法则。中文译名参考《分枝杆菌菌种中文译名原则专家共识》。
6.2 新菌种命名权的认定
按国际系统原核生物学委员会的规定，任何鉴定和命名的细菌的新分类单元，其相关论文都应发表
在《国际系统与进化微生物学杂志》(International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology)，如在其他杂志发表，应提交论文副本给该杂志公布。
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附录A
（规范性）
用于新菌种鉴定的分枝杆菌培养和生化试验方法见表A.1。
表A.1 用于新菌种鉴定的分枝杆菌培养和生化试验方法
序号试验名称是否必须具体方法参见以下文件
1 产色、光反应是
1. V V Lévy-Frébault, F Portaels. Proposed minimal
standards for the genus Mycobacterium and for
description of new slowly growing Mycobacterium
species. Int J Syst Bacteriol.
1992;42(2):315-323.
2. 中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验
规程.北京：中国教育文化出版社,2006.
3. 赵雁林，逄宇.结核病诊断实验室检验规程.北京：人民
卫生出版社,2015.
2 不同温度生长试验是
3 耐异烟肼试验是
4 耐噻吩-2-羧酸肼试验是
5 耐羟胺试验是
6 耐对硝基苯甲酸试验是
7 耐氯化钠试验是
8 耐胺硫脲试验是
9 耐苦味酸试验是
10 耐油酸试验是
11 过氧化氢酶试验是
12 吐温-80 水解试验是
13 尿素酶试验是
14 烟酸试验是
15 硝酸还原试验是
16 酸性磷酸酶试验是
17 芳基硫酸酯酶试验是
18 吡嗪酰胺酶试验是
19 α-酯酶活性试验是
20 生长速度是
21 铁离子吸收试验否
22 亚碲酸盐还原试验否
23 麦康凯琼脂培养基生长
试验
否
24 谷氨酸钠葡萄糖琼脂培
养基生长试验
否
25 其他否其他
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7
附录B
（资料性）
用于16S rDNA、hsp65、rpoB、sodA 等基因扩增的常用引物序列
用于16S rDNA、hsp65、rpoB、sodA 等基因扩增的常用引物序列见表B.1。
表B.1 用于16S rDNA、hsp65、rpoB、sodA 等基因扩增的常用引物序列
序列名称上游序列下游序列
全长16S rDNA 27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’） 1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）
部分hsp65 HSPF3 (5’-ATCGCCAAGGAGATCGAGCT-3’） HSPR4 (5’-AAGGTGCCGCGGATCTTGTT-3’）
rpoB Ⅲ高可变区MF（5’-CGACCACTTCGGCAACCG -3’） MR（5’-TCGATCGGGCACATCCGG -3’）
ITS ITS1-1511F（5’-AAGTCGTAACAAGGTARCCG-3’） ITS1-23R（5’-TCGCCAAGGCATCCACC-3’）
sodA Sod A-F（5’- GGCCAGGTTCTTCTCGTTCA -3’） SodA-R（5’-CGCCGCATATGTCAAAGGTG -3’）
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附录C
（资料性）
使用全基因组数据进行原核生物分类标准
C.1 以分类为目的的基因组序列数据的最低标准
C.1.1 DNA 测序平台
尽管不同的微生物学分类标准对最终组装的重叠群的准确性和质量有不同的要求，但以分类为目的
而产生的基因组序列也应用于其他领域，如环境和临床微生物学。目前，MGISEQ、Illumina、Ion Torrent
和Pacific Biosciences 等提供的DNA 测序平台通常生成符合一般标准的DNA 序列数据。任何其他未来
可用的新一代测序(next generation sequencing, NGS)平台在用于原核生物分类学研究之前,都应经过
严格的评估。
C.1.2 原始NGS 数据和组装基因组序列的质量
C.1.2.1 基因组大小
基因组大小定义为所有重叠群（contigs）的长度总和。如果基因组序列未完全确定，则该值仅代
表近似值。
C.1.2.2 片段重叠群的数量和N50
基因组组装过程产生不同长度的重叠群。通常情况下，首先需要从最终装配中排除非常短的重叠部
分。在选择片段重叠群方面没有明确的标准，单重叠群的数量不能很好地反映基因组序列的质量。可使
用已知的N50 对最终组装进行更准确的评估。N50 定义为将重叠群的长度从最长到最短相加，累计50%
的最短重叠群长度。
C.1.2.3 测序覆盖深度
该值通常用倍数（fold）来反映。这个统计数据可在所有DNA 测序平台上用适当的基因组组装软件
进行测量。对于具有不同精度和读取长度的NGS 平台，很难推荐单个值作为标准。理论上，生成的fold
读取越多，组装的质量越好。宜将目前NGS 平台（illumina、Ion Torrent 和Pacific Biosciences）
的测序深度设置为50 倍及以上。
C.1.3 基因组组装的真实性
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在基因组测序过程中，菌株及其基因组数据常常被错误地标记，导致出现错误的分类。这在一定程
度上是因为基因组测序过程中的错误标记和污染的可能性相对较高。因此，需要核对获得的基因组序列
是否确实属于被测菌株。
因为几乎所有已知物种类型菌株的16S rDNA 序列都是可用的，所以该基因可用于确认最终基因组
组装序列的真实性。对于系统发育学相近的16S rDNA 序列非常相似的物种，gyrB、rpoB 和recA 等蛋
白质编码基因，可用于进一步支持基因组数据的真实性。为了实现这一点，应从基因组组装序列中提取
全长16S rDNA 或蛋白质编码基因。如果多个rRNA 操纵子中的16S rDNA 序列之间存在实质性差异，则
应通过分子克隆和测序来解决这一问题。为了描述新菌种，应通过常规Sanger 测序获得系统发育学相
近菌种标准菌株的全长16S rDNA 序列，并与从被测菌株全基因组组装序列中提取的16S rDNA 序列进行
比较，以确保基因组数据的真实性。如果不能从基因组组装序列中提取全长16S rDNA 序列，可使用其
他蛋白质编码基因代替16S rDNA 序列。但无论在哪种情况下，应获得来自系统发育学相近菌种的标准
菌株全长16S rDNA 序列。
C.1.4 基因组组装中的污染
NGS 可生成高通量数据，其测序覆盖深度比传统的Sanger 测序更高，但缺点是容易产生DNA 污染。
即使是少量DNA 污染，也可能被纳入基因组组装中。由于在分枝杆菌领域中横向基因转移事件的发生频
率不高，可使用蛋白质编码基因检查污染情况。
C.2 测序数据的保存
由于基因组序列组装过程可能很难复制，宜避免仅保存原始NGS 数据（没有最终组装）。组装后的
基因组数据应存入GenBank/EMBL/DDBJ 数据库，或其他已被认可的公用数据库。
C.3 从公共领域选择参考基因组数据
目前，很多菌种可获得多个基因组序列。因此，选择质量最好的真实基因组序列进行OGRI 和系统
发育树分析非常重要。选择具有最佳质量的基因组序列的标准是依据N50 值，N50 值越大，基因组数据
质量越高。此外，分类学研究中的参考基因组应是被检测菌种的标准菌株。
C.4 分类目的的生物信息学
C.4.1 基因组数据识别新菌种
DDH 被定义为原核生物的物种边界，至今仍作为原核生物分类学的金标准。ANI 广泛应用于计算系
统发育进化上相近菌种间的分类。ANI 的替代指标是dDDH ， 可通过网站进行计算
（https://ggdc.dsmz.de/ggdc.php），也被广泛用于分类鉴定。
C.4.2 基因组数据识别亚种
目前，尚无使用基因组数据定义亚种的指南，一般认为包括以下标准：
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a）亚种和其他菌种之间的ANI 应低于菌种水平的临界值；
b）亚种之间的ANI 应高于菌种水平的临界值；
c）属于不同亚种的菌株应在基因组上一致，并通过ANI 和系统发育树形成可区分的分支；
d）亚种应通过足够数量的表型进行区分；
e）命名亚种应有一个合理的理由来解释。
C.4.3 系统进化树
鉴于基因组序列中存在的大量信息，能够在不同的分类水平上探索更精确的系统发育关系。将基因
组数据应用于系统发育分析，称为系统发育树，可通过基于多个基因而不是单个基因（如16S rDNA）
推断系统发育树来实现。系统基因组学应提供更好的分类框架，特别是在属和更高层次上。针对分枝杆
菌常用的系统进化分析的基因常包括16S rDNA、rpoB、hsp65 及rpsA。
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附录D
（资料性）
新菌种鉴定流程图
新菌种鉴定流程图见图B.1。
图B.1 新菌种鉴定流程图
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12
附录E
（资料性）
具有国际影响力的菌种保藏中心及其缩略名称
具有国际影响力的菌种保藏中心及其缩略名称见表E.1。
E.1 具有国际影响力的菌种保藏中心及其缩略名称
菌种保藏中心缩略名词
美国典型菌种保藏中心ATCC
中国典型培养物保藏中心CCTCC
瑞典哥德堡大学菌种保藏中心CCUG
美国疾病预防与控制中心CDC
西班牙典型菌种保藏中心CECT
中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC
法国巴斯德研究所菌种保藏中心CIP
中国医学细菌保藏管理中心CMCC
法国立克次体株保藏中心CSUR
德国微生物菌种保藏中心DSM
芬兰赫尔辛基大学农业和林业系应用化学和微生物
部门菌种保藏中心
HAMBI
法国国家卫生保健质量控制中心INCQS
日本微生物保藏中心JCM
韩国典型菌种保藏中心KCTC
英国国家典型菌种保藏中心NCTC
比利时根特大学微生物学实验室LMG
日本技术评价研究所生物资源中心NBRC
荷兰细菌保藏中心NCCB
英国国家工业、食品、海洋细菌保藏中心NCIMB
全俄微生物保藏中心VKM
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参考文献
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