DB54/T 0449-2025 藏猪副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌三重实时荧光定量PCR检测技术规范

以下是西藏自治区地方标准​​DB54/T 0449-2025​​的详细内容总结：

​​1. 范围​​

• 适用于​​藏猪​​的​​肺部组织、鼻腔或气管分泌物​​中以下三种病原体的定性与定量检测：
  • ​​副猪嗜血杆菌（HPS）​​
  • ​​多杀性巴氏杆菌（PM）​​
  • ​​胸膜肺炎放线杆菌（APP）​​
• 检测方法：​​三重实时荧光定量PCR​​。

​​2. 规范性引用文件​​

• 包括实验室安全（GB 19489、NY/T 1948）、样品管理（NY/T 541）、废弃物处理（SN/T 4835）及用水标准（GB/T 6682）。

​​3. 术语与缩略语​​

• ​​关键术语​​：
  • ​​实时荧光定量PCR​​：通过荧光信号实时监测PCR进程。
  • ​​循环阈值（Ct值）​​：荧光信号达到设定阈值的循环数。
• ​​缩略语​​：
  • HPS、PM、APP（病原体）；FAM/VIC/CY5（荧光探针）；BHQ1/BHQ2（淬灭基团）；ROX（参比染料）；NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）；TSB（胰蛋白胨大豆肉汤）；TE缓冲液等。

​​4. 仪器设备​​

• 核心设备：​​荧光定量PCR仪​​、高速冷冻离心机、生物安全柜、高压灭菌锅、恒温振荡器、微量移液器等。

​​5. 试剂与耗材​​

• ​​必需试剂​​：
  • 商品化FBS（胎牛血清）、NAD贮存液（附录A配制）、增菌培养液（TSB + FBS + NAD）。
  • ​​荧光定量预混液​​（如PerfectStart® II Probe qPCR SuperMix UDG）。
  • ​​引物与探针​​（序列见附录C）：
    • HPS靶标基因：infB（FAM标记）
    • PM靶标基因：kmt1（VIC标记）
    • APP靶标基因：apxIV（CY5标记）
  • ​​阳性质粒对照​​（附录B构建，浓度10³~10⁶ copies/μL）。
• ​​耗材​​：无菌PCR管、避光离心管、采样拭子等。

​​6. 样品采集与处理​​

• ​​采样要求​​：
  • ​​组织样品​​：≥5g病变肺部组织，无菌采集。
  • ​​棉拭子样品​​：鼻腔插入2~3cm，旋转后置于增菌培养基。
• ​​保存与运输​​：
  • 短期：4℃（≤24h）；长期：-20℃（≤1个月）或-80℃（≤6个月）。
  • 需符合NY/T 541低温运输规范。
• ​​前处理​​：
  • 组织样品：0.5~1g接种至2.5mL增菌液，37℃振荡培养16~24h。
  • 棉拭子：取100μL接种增菌液，同条件培养。

​​7. 核酸提取​​

• 使用​​商品化DNA提取试剂盒​​（革兰氏阴性菌或通用型），按说明书操作提取增菌培养物DNA。

​​8. 三重实时荧光定量PCR​​

• ​​反应体系​​（25μL）：

  组分	体积/用量
  2× qPCR SuperMix	12.5 μL
  引物（各0.6~0.7μL）	三组共4.0 μL
  探针（各0.6~0.7μL）	三组共2.0 μL
  ROX参比染料	按仪器要求添加
  DNA模板	1 μL
  ddH₂O	补至25 μL

• ​​反应程序​​：
  • 94℃预变性5分钟 → 40循环（94℃ 5秒 → 60℃ 30秒）。

​​9. 结果判定​​

• ​​质控标准​​：
  • 阴性对照：无Ct值/无扩增曲线。
  • 阳性对照：Ct值≤35且对数增长曲线明显。
• ​​样品判定​​：
  • ​​阳性​​：Ct值≤35 + 典型扩增曲线。
  • ​​阴性​​：无Ct值/无扩增曲线。
  • ​​可疑​​（Ct>35）：需复测；复测Ct≤35判阳性，否则阴性。

​​10. 生物安全措施​​

• 全过程需符合：
  • GB 19489（实验室安全）、NY/T 1948（兽医实验室安全）、SN/T 4835（废弃物管理）。

​​附录内容概要​​

• ​​附录A​​：培养基配制（NAD贮存液、增菌培养液配方）。
• ​​附录B​​：阳性质粒构建（基于NCBI参考菌株基因保守序列）。
• ​​附录C​​：引物与探针序列（详列三组靶标引物及探针）。
• ​​附录D​​：荧光定量PCR反应体系与程序（标准化操作流程）。

​​核心意义​​

该标准为西藏地区藏猪的​​HPS、PM、APP混合感染​​提供了​​高特异性、高灵敏度​​的检测方案，通过​​三重荧光PCR技术​​实现单次反应同时鉴定三种病原体，提升疫病监控效率，保障藏猪养殖业健康发展。