DB53/T 1340-2025 香石竹品种真实性鉴定 SNP分子标记法
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- 标准类型：食品地方标准
- 标准语言：中文版
- 文件类型：PDF文档
- 更新时间：2025-05-20
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资料介绍
《DB53/T 1340-2025 香石竹品种真实性鉴定 SNP分子标记法》标准的主要内容总结：
一、范围
- 规定了利用SNP分子标记技术鉴定香石竹品种真实性的方法，涵盖鉴定准备、操作流程、数据分析和判定标准。
- 适用于香石竹品种的真实性鉴定，包括核心引物验证和辅助引物扩展验证。
二、规范性引用文件
- 引用GB/T 1.1-2020《标准化工作导则》和GB/T 6682《分析实验室用水规格和试验方法》。
三、鉴定准备
1. 仪器设备
- 包括电泳仪、离心机、微量移液器、分光光度计、组织研磨仪、KASP检测设备等。
2. 试剂
- 主要试剂：CTAB、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、EDTA、Tris-HCl、β-巯基乙醇等。
- 关键溶液配方：
- CTAB提取液：含20.0 g CTAB、81.7 g NaCl、20.0 g聚乙烯吡咯烷酮等。
- TE缓冲液：pH 8.0的Tris-EDTA溶液。
3. KASP引物
- 核心引物15个（附录A.1），其他辅助引物15个（附录A.2），每个SNP位点含3条引物（FAM、HEX荧光标记引物及通用反向引物）。
四、操作流程
1. 样品准备
- 随机选取5株以上植株的叶片，确保样本代表性。
2. DNA提取（CTAB法）
- 步骤：液氮研磨→CTAB裂解→三氯甲烷抽提→异丙醇沉淀→乙醇洗涤→TE溶解。
- 质量要求：OD260/OD280=1.8~2.0，OD260/OD230>2.0，电泳检测无降解。
3. 基因分型检测
- 引物设计：每个SNP位点设计2条荧光标记正向引物（FAM/HEX）和1条通用反向引物。
- PCR反应体系：总体系5μL，含2.5μL KASP Master Mix、0.05~0.06μM引物和2μL DNA模板。
- 反应程序：预变性95℃ 10min，10轮降落PCR（退火温度61℃→55℃），35轮常规扩增。
4. SNP分型
- 荧光扫描检测扩增产物，通过分型图和数据判定等位基因型（XX、YY、XY或--）。
五、数据分析与判定
1. 数据记录
- 纯合位点记录为XX/YY，杂合为XY，缺失为--。
- 示例：DSNP004位点基因型GG、AA或--。
2. 比对与统计
- 逐一比对样品与对照的等位变异数据，统计差异位点数。
3. 判定标准
- 不同品种：差异位点数≥3。
- 疑同品种：差异位点数≤2，需结合表型观测辅助判定。
六、附录内容
附录A.1（核心引物）
- 15个核心SNP位点信息，包括染色体位置、等位变异、引物序列及侧翼序列。
- 示例：DSNP002位点（染色体1）等位变异为T/C，引物含FAM/HEX标记。
附录A.2（其他引物）
- 15个辅助SNP位点，用于补充验证，结构与核心引物类似。
七、关键技术点
- KASP技术：基于竞争性等位基因特异性PCR，通过荧光信号区分SNP位点。
- 质量控制：DNA纯度要求严格，PCR扩增需通过内参荧光（ROX）校准。
- 判定灵活性：允许少量差异位点（≤2）存在，结合表型验证提高准确性。
八、适用范围与意义
- 为云南省香石竹品种鉴定提供标准化方法，适用于品种权保护、市场监管及育种研究。
- 通过分子标记技术实现快速、准确的真伪鉴别，推动花卉产业规范化发展。
此标准通过详细的技术流程和判定标准，确保了香石竹品种鉴定的科学性和可操作性，具有重要的实践指导意义。