DB32/T 4644.4-2025 从业人员健康检查 第4部分：伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、志贺氏菌和痢疾阿米巴检验方法
- 文件大小：663 KB
- 标准类型：综合地方标准
- 标准语言：中文版
- 文件类型：PDF文档
- 更新时间：2025-05-18
- 下载次数：
- 标签：
资料介绍
江苏省地方标准 DB32/T 4644.4-2025 主要内容总结
1. 标准适用范围
- 适用对象：公共场所、食品生产/加工/流通/餐饮、饮用水行业从业人员健康检查，检测粪便/肛拭子中的以下病原体：
- 伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、志贺氏菌、痢疾阿米巴。
- 扩展应用：医疗卫生用品、化妆品等行业可参照执行。
2. 规范性引用文件
- 主要引用标准包括：
- GB 4789.4（沙门氏菌检验）
- GB 19489（实验室生物安全）
- WS 280（伤寒/副伤寒诊断）
- WS 287（细菌性/阿米巴性痢疾诊断）
- WS 289（霍乱诊断）。
3. 核心检验方法
- 筛查试验：基于实时荧光PCR技术，通过特异性引物和探针检测病原体核酸。
- 靶基因设计：针对各病原体特异性基因序列（如伤寒沙门氏菌的保守基因、痢疾阿米巴的18S rRNA等）。
- Ct值判定：
- 阴性：Ct值>40或无扩增曲线；
- 阳性：Ct值<35且曲线呈指数增长；
- 可疑阳性（35≤Ct≤40）需复测确认。
- 确证试验：针对PCR阳性样本，通过传统微生物学方法验证：
- 增菌培养（如霍乱弧菌用碱性蛋白胨水，沙门氏菌用RVS/TTB增菌液）；
- 分离培养（如XLD琼脂、MAC琼脂、TCBS琼脂等）；
- 生化鉴定（如三糖铁试验、赖氨酸脱羧酶试验）；
- 血清学分型（使用沙门氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌诊断血清）。
4. 操作流程
- 标本采集与处理：
- 肛拭子插入直肠3-5cm旋转采集，或蘸取粪便置于含生理盐水的采样管。
- 运输保存：2-8℃保存≤24小时，避免反复冻融。
- 前增菌处理：
- 样本混匀后加入营养肉汤（NB），36℃±1℃增菌3-6小时。
- 混合样本筛查：5-10份样本混合检测，阴性直接报告，阳性需单样本确证。
- 实时荧光PCR检测：
- DNA提取：离心后使用DNA提取液裂解，煮沸法制备模板。
- 反应体系：25μL（含引物、探针、Taq酶、UNG酶），分A/B管检测不同病原体组合（A管：沙门氏菌、霍乱弧菌；B管：志贺氏菌、痢疾阿米巴）。
- 扩增条件：50℃ 2min → 95℃ 2min → 40循环（95℃ 5s，60℃ 30s）。
- 结果判读：
- 阳性对照必须扩增（Ct≤30），阴性/空白对照无扩增。
- 多通道检测（FAM、VIC、CY5）区分不同病原体（见表1）。
- 确证试验：
- 增菌与分离：针对阳性结果选择特定培养基（如霍乱弧菌用TCBS琼脂，志贺氏菌用MAC/XLD琼脂）。
- 生化鉴定：如动力-靛基质-尿素（MIU）试验、氧化酶试验。
- 血清凝集：排除自凝后，使用诊断血清确定菌型。
5. 关键试剂与设备
- 培养基：共19种（附录A详述配制方法），包括：
- 增菌液（碱性蛋白胨水、TTB、RVS）；
- 选择性培养基（BS琼脂、HE琼脂、TCBS琼脂）；
- 生化鉴定培养基（TSI、KIA、糖发酵管）。
- 设备：
- II级生物安全柜、实时荧光PCR仪、全自动微生物生化鉴定系统、离心机（≥12000×g）等。
- 试剂：
- 荧光PCR试剂（引物/探针序列见附录B）、诊断血清、DNA提取液（含NP-40）。
6. 生物安全要求
- 实验操作需符合GB 19489，涉及高危病原体（如霍乱弧菌）时需在生物安全二级（BSL-2）实验室进行。
- 废弃物处理：PCR反应管按医疗废物处理，防止污染。
7. 附录内容
- 附录A：培养基与试剂配制方法（如营养肉汤、TTB增菌液、XLD琼脂等）。
- 附录B：实时荧光PCR的引物/探针序列及反应体系参数，明确各病原体检测通道（FAM/VIC/CY5）对应关系。
8. 标准意义
- 补充现有国标/行标，规范从业人员健康检查流程，提升病原体检出效率。
- 结合分子生物学（PCR）与传统微生物学方法，兼顾快速筛查与精准确认。
- 保障食品、公共卫生安全，落实“健康中国2030”战略。
总结：该标准系统整合了分子诊断技术与传统培养鉴定方法，通过两阶段（筛查+确证）检测流程，高效识别从业人员携带的肠道病原体，为防控传染病传播提供技术依据。附录详实的操作指南和试剂配制方法，增强了标准的实用性和可操作性。