DB15/T 4173-2025 牛大肠杆菌性腹泻诊断技术规范

　　内蒙古自治区地方标准

　　DB15/T 4173—2025

　　牛大肠杆菌性腹泻诊断技术规范

　　Technical specification for the diagnosis of bovine Escherichia coli diarrhea

　　2025-08-29发布

　　2025-09-29实施

　　内蒙古自治区市场监督管理局 发布

　　DB15/T 4173—2025

　　I

　　前言

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会(SAM/TC 19)归口。

　　本文件起草单位：内蒙古农业大学、鄂尔多斯市动物疫病预防控制中心、北京生泰尔科技股份有限公司、北京华夏兴洋生物科技有限公司、金宇保灵生物药品有限公司、通辽市科尔沁区畜牧水产工作站、内蒙古自治区农牧业科学院。

　　本文件主要起草人：徐晓静、谢梦圆、张勇、王秀敏、赵卓、陈坚、韩四娥、张迪、达来宝力格。

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　　牛大肠杆菌性腹泻诊断技术 牛大肠杆菌性腹泻诊断技术 牛大肠杆菌性腹泻诊断技术 牛大肠杆菌性腹泻诊断技术 规范

　　1 范围

　　本文件规定了牛大肠杆菌性腹泻的临床诊断和实验室诊断技术。

　　本文件适用于牛大肠杆菌性腹泻的检测。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB 4789.6 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验

　　GB 19489 实验室 生物安全通用要求

　　NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。 下列缩略语适用于本文件。 下列缩略语适用于本文件。 下列缩略语适用于本文件。 下列缩略语适用于本文件。 下列缩略语适用于本文件。

　　EAEC：肠黏附性大肠杆菌 ( Enteroaggregative Escherichia coli )

　　DEC：致泻大肠杆菌 (Diarrheagenic Escherichia coli )

　　EHEC：肠出血性大肠杆菌 ( Enterohemorrhagic Escherichia coli )

　　EIEC：肠侵袭性大肠杆菌 ( Enteroinvasive Escherichia coli )

　　EPEC：肠致病性大肠杆菌 ( Enteropathogenic Escherichia coli )

　　ETEC：肠产毒素性大肠杆菌 ( Enterotoxigenic Escherichia coli )

　　EMB：伊红美蓝 ( Eosin-methylene Blue )

　　PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)

　　RNase：核糖核酸酶(Ribonuclease)

　　MAC：麦康凯琼脂 ( Mac Conkey Agar )

　　MLST：细菌多位点序列分型 ( Multilocus sequence typing )

　　STEC：产志贺毒素大肠杆菌 ( Shiga toxin-producing Escherichia coli )

　　5 临床诊断 流行病学

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　　5.1.1 易感性

　　不同品种牛均易感，多见于3周龄以内的犊牛，7日龄内犊牛最易感。

　　5.1.2 流行性

　　一年四季均可发生，尤以气候多变、寒冷季节和环境卫生较差时多发，呈地方性流行或散发。

　　5.1.3 传染源及传播途径

　　病牛和带菌牛是主要传染源，通过粪便排出病菌，污染水、饲料、乳头和皮肤等，当犊牛吮乳、舐舔或饮食时，经消化道感染。此外，也可经脐带或产道感染。 临床症状

　　多数是7日龄以内犊牛发病，病初体温升高至40 ℃以上，数小时后开始腹泻，有的病牛体温可降至正常。初期腹泻物呈黄色粥样，后期呈灰白色水样，有的混有未消化的凝乳块、血液及泡沫，有酸臭气味。末期犊牛肛门失禁，常腹痛，用蹄踢腹部。有的病程长的犊牛表现发育迟滞和呼吸困难等症状。有的犊牛出现腹泻后急性死亡。 病理变化

　　皱胃黏膜和小肠黏膜充血、水肿，可能见出血斑点。肠系膜淋巴结肿大。胆囊严重扩张，充满暗绿色胆汁。心外膜和心内膜散在或弥漫分布出血斑点。急性炎性脾肿，脾脏肿大和质软，部分病例脾脏表面可见出血斑点，其它组织器官也可能见出血斑点。经脐带感染的病例可见出血性脐炎和出血性脐动脉炎。病程长的病例可能伴有浆液纤维素性关节炎和出血性或浆液性出血性肺炎。

　　6 实验室诊断 主要仪器设备

　　恒温培养箱(37 ℃±2 ℃)、漩涡振荡器、倒置显微镜、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、微量可调移液器(规格100 μL～1000 μL、20 μL～200 μL、1 μL～20 μL)、高速台式冷冻离心机(4 ℃，离心速度12000 r/min 以上)、冰箱(2 ℃～8 ℃、-20 ℃和-70 ℃)、自动微生物生化鉴定系统。 主要试剂

　　除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNase污染的容器分装。

　　生理盐水、营养琼脂平板、细菌微量生化反应管及指示剂、无霉水、PCR酶、DNA Marker(DL 500、DL 2000)。 样品采集与处理

　　6.3.1 生物安全措施

　　样品的采集按照NY/T 541的规定进行。

　　样品处理的生物安全措施符合GB 19489的规定。

　　6.3.2 粪便样品

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　　将无菌棉拭子伸入肛门内刮取新鲜粪便，也可无菌采集刚排出的新鲜粪便。分别放入盛有灭菌生理盐水的采样管中，编号并记录相关信息。

　　6.3.3 组织样品

　　取病死牛肠组织及内容物、脐带、肝、脾等，置于采样杯内。 病原检测

　　6.4.1 细菌分离

　　无菌条件下，将样品接种于MAC或EMB琼脂平板，37 ℃±2 ℃ 培养 16 h～24 h，观察菌落特征。在MAC琼脂平板上，多数大肠杆菌呈桃红色或粉红色菌落，有的也呈无色菌落;在EMB琼脂平板上，多数大肠杆菌呈紫黑色带金属光泽的菌落，有的呈无色或琥珀色半透明菌落。

　　挑取单个疑似菌落接种于MAC或EMB琼脂平板，37 ℃±2 ℃ 培养16 h～24 h进行鉴定。

　　6.4.2 革兰染色镜检

　　挑取MAC或EMB琼脂平板上的大肠杆菌特征性菌落，经营养琼脂平板纯化后制备涂片，自然干燥，革兰染色，镜检可见两端钝圆的粉红色革兰阴性短杆菌，散在或成对存在。

　　6.4.3 生化鉴定

　　根据《伯杰细菌手册》对大肠杆菌进行生化特性鉴定。

　　挑取符合大肠杆菌形态学特征的单个菌落接种细菌微量生化反应管，进行甲基红试验、吲哚(靛基质)试验、枸橼酸盐试验、V-P试验、硫化氢试验、三糖铁试验、尿素酶试验、糖类分解试验(葡萄糖、乳糖、甘露糖、蔗糖)等。

　　甲基红试验、吲哚试验、葡萄糖和甘露糖发酵试验结果呈阳性，枸橼酸盐试验、V-P试验、尿素酶试验结果呈阴性，三糖铁琼脂斜面呈黄色、底层产气，几乎不产生硫化氢，大多数菌株可迅速发酵乳糖，仅极少数迟发酵或不发酵，约半数菌株不分解蔗糖，符合以上生化反应说明符合大肠杆菌特性。也可用自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。

　　6.4.4 PCR鉴定

　　6.4.4.1 DNA提取

　　将采集的样品进行处理，按DNA提取试剂盒方法提取核酸。-20 ℃以下保存。

　　6.4.4.2 DEC PCR检测

　　按照GB 4789.6对DEC(ETEC、EHEC、EIEC、EPEC、EAEC、STEC)进行PCR检测。

　　6.4.5 测序鉴定(选做)

　　细菌全基因组测序、16S测序、MLST等测序技术进行鉴定。

　　6.4.6 致病性鉴定(选做)

　　取健康状态良好小白鼠，分成试验组和对照组。将符合6.4.2和6.4.3或6.4.4或6.4.5结果的大肠杆菌菌株，按照细菌生长曲线制备不同浓度的菌悬液，腹腔注射试验组小鼠。注射后观察5 d～7 d，若对照组小鼠均正常，试验组小鼠精神萎靡，食欲减退至废绝，静止抱团，腹泻或死亡，无菌条件下取死亡小鼠的组织样品分离细菌，进行革兰染色镜检、生化鉴定或PCR鉴定。

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　　7 综合判定 疑似

　　符合5.1、5.2、5.3，或者6.4.2、6.4.3，可判定为疑似牛大肠杆菌性腹泻。 确诊

　　符合7.1，结合6.4.4、6.4.5、6.4.6任一结果为阳性，可确诊为牛大肠杆菌性腹泻。