DB1302/T 353-2013 平菇原生质体脱毒技术规程
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- 标准类型：食品地方标准
- 标准语言：中文版
- 文件类型：PDF文档
- 更新时间：2025-06-07
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资料介绍
DB1302/T 353-2013《平菇原生质体脱毒技术规程》主要内容总结
1. 标准概述
- 适用范围：规定了平菇菌种通过原生质体技术脱毒的实验室准备、制备、再生及鉴定流程，适用于平菇菌种的病毒脱除。
- 起草单位：唐山师范学院，由唐山市质量技术监督局提出。
- 引用标准：包括实验室规范（GB/T 27405）、食用菌术语（GB/T 12728）、平菇菌种标准（GB 19172）等10余项相关标准。
2. 术语与定义
- 平菇：层菌纲伞菌目侧耳科侧耳属的主要品种。
- 关键术语：
- 初始菌株：带毒的原始平菇菌株（病毒病原及症状见附录A）。
- 原生质体：脱去细胞壁的细胞。
- 稳渗剂：维持原生质体渗透压的稳定剂（如0.6 mol/L甘露醇）。
- 脱毒菌株：经鉴定无病毒症状的再生菌株。
3. 实验室准备
- 环境要求：符合GB/T 27405实验室质量控制规范。
- 主要设备：
- 超净工作台（无菌风≤0.5个/皿·时）、高压灭菌器（121℃）、光学显微镜（400倍）等。
- 试剂与培养基：
- 稳渗剂：0.6 mol/L甘露醇（pH 7.0）。
- 酶制剂：溶壁酶（Lywallzyme）。
- 培养基：PD液体培养基（土豆+葡萄糖）、PDA固体培养基（加琼脂）、PSA再生培养基（土豆+蔗糖+稳渗剂）。
4. 原生质体制备流程
- 菌丝体活化：初始菌株接种PDA平板，25℃培养5~7天。
- 摇瓶培养：菌丝转接PD液体培养基，25℃、180 rpm振荡培养5天。
- 菌丝破碎：离心收集菌丝球（约0.1 g），机械捣碎。
- 酶解处理：
- 溶壁酶（0.02 g/mL稳渗剂）过滤后加入菌丝碎片，35℃水浴孵育2.5小时（每30分钟混匀）。
- 分离与计数：
- 300目细胞筛过滤，显微镜观察并计数（按JJG 552-1988标准）。
5. 原生质体再生
- 静置培养：稀释原生质体至10⁵个/mL，30℃过夜培养后涂布PSA培养基。
- 菌落筛选：25℃培养至单菌落形成，转接PDA平板，选择菌丝致密、边缘整齐的再生菌株。
6. 脱毒菌株鉴定
- 真实性鉴定：
- 拮抗反应（NY/T 1845-2010）：与初始菌株对峙培养，无拮抗反应者进入下一步。
- RAPD指纹图谱（NY/T 1743-2009）：遗传学比对，筛选与初始菌株相似的再生菌株。
- 脱毒验证：
- 按DB1302/T 306-2011进行出菇试验，观察无病毒症状（如菌盖畸形、水渍斑等）。
- 合格菌株需符合GB 19172-2003平菇菌种标准。
7. 附录A（病毒病原与症状）
- 病原：包括糙皮侧耳球形病毒（OMSV）、等面体病毒（OMIV）等4类。
- 症状：
- 菌丝体：生长缓慢、边缘不齐。
- 子实体：菌盖波浪形或水渍斑、菌柄肿胀畸形、担孢子发育异常等。
核心要点
- 技术目标：通过原生质体技术获得无病毒平菇菌种。
- 关键步骤：酶解去壁→再生培养→遗传与栽培鉴定。
- 质量控制：严格遵循实验室规范、培养基配制及鉴定标准。
- 应用价值：为平菇健康菌种生产提供标准化脱毒方法，保障食用菌产业安全。
